植物贮藏组织细胞形态学定量分析方法

陈 航，蔡灿辉，张 彪，韦存虚

(扬州大学，江苏扬州 225009)



植物贮藏组织细胞形态学定量分析方法

陈 航，蔡灿辉，张 彪，韦存虚

(扬州大学，江苏扬州 225009)

[目的]为了建立植物贮藏组织细胞的形态定量分析方法。[方法]利用Photoshop软件处理显微形态图片，借助形态分析软件定量测定细胞形态参数。[结果]该方法首先详细介绍了如何利用Photoshop软件获得只含有细胞壁轮廓的显微图片过程，然后利用形态分析软件定量测定细胞的面积、圆度、长轴和短轴等形态特征。[结论]该方法不仅克服采用常规方法对植物贮藏细胞形态分析结果不准确等的缺陷，而且适用于采用不同样品制备方法获得的显微结构图。

植物贮藏组织；细胞形态；定量分析；Photoshop软件

植物贮藏组织是粮食、牲畜饲料和工业原料的主要来源。贮藏组织细胞的发育和充实状况决定着植物贮藏组织的质量和品质。对贮藏组织细胞的形态学特征进行分析，能够从细胞学角度研究植物贮藏组织的发育和充实，对提高植物贮藏组织的产量和品质具有重要的意义[1]。目前，对植物组织细胞形态学的研究主要利用显微切片技术将组织细胞切开，再通过染色显示出细胞的轮廓，最后用一些形态分析软件测定细胞的形态学指标[2]。但是，由于植物贮藏组织细胞被贮藏物质淀粉、蛋白和脂类物质所填充，染色后的细胞轮廓不够清晰，采用常规的方法无法准确定量分析植物贮藏组织细胞的形态学特征。经过长时间的摸索，笔者建立了一种植物贮藏组织细胞形态学定量分析方法。该方法可以方便、准确地分析细胞的形态学特征。以水稻成熟籽粒为例，笔者详细介绍了该分析方法的具体操作过程，为植物贮藏组织细胞的形态学定量分析提供重要参考。

1 材料与方法

1.1 水稻种子半薄切片的制备、染色和拍照

以水稻成熟种子为材料，参考杨洋[3]的常规LR white树脂包埋法对样品进行固定、脱水、树脂渗透和包埋，获得样品包埋块。将包埋块置于莱卡超薄切片机上，利用玻璃刀切取2 μm厚的半薄切片，将切片黏于载玻片上；利用碘液对样品中的淀粉进行染色；在奥林巴斯显微镜下观察和拍照染色后的样品，获得显微图片。

1.2 显微图片的处理

用Photoshop软件对显微图片进行处理，获得只显示细胞轮廓的图片。具体步骤如下：

(1)用Photoshop软件打开拍摄的图片，用“矩形选框工具”选出待分析的区域，点选菜单栏的“编辑”-“拷贝”，再点选“文件”-“新建”，在弹出的对话框中将背景内容改为“背景色”，点击“确定”新建一个像素与待分析的区域相同的画布。

(2)点选菜单栏的“编辑”-“黏贴”，将待分析的区域复制到新画布上。

(3)选择“钢笔工具”，逐一对细胞壁进行精确勾勒，按“ESC”键完成勾勒。

(4)打开“路径面板”，双击“路径图标”，输入路径名称，点击“确定”保存路径。

(5)选择“画笔工具”，在“画笔工具栏”中将“大小”改为“3”像素，“硬度”改为“100%”。

(6)选择“钢笔工具”，右击画好的“路径”，在弹出菜单中选择“描边路径”，在对话框中选择“画笔工具”，点击“确定”，待分析区域清晰地显示出胚乳细胞的轮廓。

(7)在“图层面板”中右击“背景图层”，在弹出菜单中选择“复制图层”，点击“确定”生成名称为“背景副本”的图层，拖动该图层至最顶端，右击“路径”，在弹出菜单中选择“描边路径”，在对话框中选择“画笔工具”，点击“确定”，显示出背景为黑色、细胞轮廓为白色的图像。

(8)点选菜单栏的“文件”-“存储为”，保存为TIF格式的无损图片。

1.3 细胞形态学分析

经Photoshop软件处理的细胞轮廓图片可以用任何一种形态分析软件进行分析。以下是笔者使用美国Media Cybernetics公司研发的一款图像分析软件Image-Pro Plus(IPP)对细胞轮廓图片进行分析的过程。

(1)标尺设定。用IPP软件打开C1型测微尺图片，点选菜单栏的“Measure”-“Calibration”-“Spatial”，在弹出的窗口中点选“New”新建标尺，在上方的“Name”一栏下的“spatial cal 0”处点一下，输入标尺名“10X”。“Unit”一栏选择“μm”作为单位，勾选“convert when change unit”。点选“Units/pixel”一栏中的“Image”，弹出“scaling”对话框，同时在标尺图片左上角显出一个标尺，将鼠标移到这个标尺的横杠上，点一下左键，光标就立即变成小手，就用这个小手把标尺拖下来，再将小手依次移到横杠的左右两端，利用“放大镜”工具，用左键拖这两个端点到图片两边的标尺处，在“scaling”对话框中填上标尺长度，点击“OK”关闭对话框。

(2)定义标尺。点选菜单栏的“Measure”-“Calibration”-“Select Spatial”，在弹出的窗口中点选新建的“10X”标尺。

(3)点选菜单栏的“Measure”-“count/size”，弹出“count/size”对话框。

(4)点选对话框菜单栏的“Measure”-“Select Measurements”，弹出“Select Measurements”对话框，点选所需测量的参数，这里选择“Area(面积)”“Roundness(圆度)”“Size(length)(长轴长度)”和“Size(width)(短轴长度)”，点击“OK”返回“count/size”对话框。

(5)点选“Automatic Dark Objects”，勾上“Measure Objects”“Apply Filter Ranges”和“Display Objects”复选框，点击“Count”按钮完成参数的计算。

(6)点选对话框菜单栏的“View”-“Measurement Data”，获得胚乳细胞形态学特征的统计数据，其中面积单位为μm2，圆度单位为μm2/μm2，长度单位为μm。

(7)各参数的含义。“Area”表示测量对象的面积；“Roundness”表示对象的圆度，计算公式 =(周长2)/(4×π×面积)；圆物体的圆度为1，其他形状圆度大于1；“Size(length)”表示对象沿主轴(长轴)方向的对象投影轮廓两边界平行线间的距离直径；“Size(width)”表示对象沿副轴(短轴)方向的对象投影轮廓两边界平行线间的距离直径。

2 结果与分析

图1显示水稻胚乳切片显微结构图。胚乳细胞内充满淀粉，细胞壁轮廓可以被辨认，但无法直接用软件分析胚乳细胞形态。使用该研究中介绍的方法，可以方便、准确地勾划出细胞壁(图2)。将图1的背景删除，保留勾划的细胞壁，获得只含有细胞壁轮廓的图3。利用形态分析软件，可以对图3的每个胚乳细胞形态进行快速、批量和准确地定量分析，获得每个细胞的相关信息(表1)。

表1 细胞形态学参数

随着人们研究工作的深入，越来越多的定量分析取代了以前的定性分析。近年来，图像分析软件在植物组织细胞形态中的定量分析中得到迅速普及[4-5]。然而，由于植物不同组织的特殊性，一些植物组织如富含内含物的贮藏组织很难利用图像分析软件获得可靠性的定量分析结果。笔者首先利用Photoshop软件对要分析的显微结构图片进行处理，再运用图像分析软件批量、快速和准确地分析每个细胞的形态学特征。该方法不仅适用于树脂半薄切片，而且适用于石蜡切片。只要获得的显微结构图中能够辨别细胞壁的轮廓，就能用该方法进行定量分析。

3 结论与讨论

利用该研究所建立的方法，可以方便、准确地对植物细胞形态进行定量分析。该方法能够对不同植物组织来源的

不同样品制备方法获得的显微结构图进行准确、定量分析，为植物细胞形态学的定量分析提供准确、可靠的测定方法。

[1] CAI C，HUANG J，ZHAO L，et al.Heterogeneous structure and spatial distribution in endosperm of high-amylose rice starch granules with different morphologies [J].Journal of agricultural and food chemistry，2014，62：10142-10152.

[2] 王永平，许科帝，郑筱祥.线粒体形态学全自动定量分析方法[J].计算机应用，2010，30(11)：2991-2994.

[3] 杨洋.抑制淀粉分支酶基因表达影响稻米外观品质的细胞学和发育学研究[D].扬州：扬州大学，2014：15-16.

[4] 刘智，王玲玲，周卫东，等.用Image J分析水稻胚乳淀粉粒表面几何特征的方法[J].电子显微学报，2011，30(4/5)：466-471.

[5] 余徐润，周亮，荆彦平，等.Image-Pro Plus软件在小麦淀粉粒显微图像分析中的应用[J].电子显微学报，2013，32(4)：344-351.

Quantitative Analysis Method of Cell Morphology of Plant Storage Tissue

CHEN Hang, CAI Can-hui, ZHANG Biao et al

(Yangzhou University, Yangzhou, Jiangsu 225009)

[Objective] A quantitative analysis method was established to accurately analyze the cell morphology of plant storage tissue. [Method] Microphotograph was treated by Photoshop software, and cell morphology was quantitatively analyzed by morphology analysis software. [Result] The method firstly introduced the detail processes to obtain the microphotograph with only cell wall by Photoshop software. The cell morphology, such as area, roundness, long axis and short axis, was quantitatively investigated using morphology analysis software. [Conclusion] The method is not only more accurate with quantitative analysis of the cell morphology of plant storage tissue than the routine method, but also applicable to the microphotographs obtained from different sample preparation methods.

Plant storage tissue; Cell morphology; Quantitative analysis; Photoshop software

国家自然科学基金面上项目(31270221)。

陈航(1969- )，男，江苏扬州人，中级职称，从事仪器设备管理研究工作。

2015-11-20

S-03

A

0517-6611(2015)35-001-02