压裂液增稠剂降解菌的诱变育种研究*

李慧玲，刘祖艳，赵 敏*

（1.黑龙江中医药大学 药学院，黑龙江 哈尔滨150040；2.东北林业大学 生命科学学院，黑龙江 哈尔滨150040）

目前，石油的开采难度逐渐增加，向油井注入压裂液是增产的重要措施之一。为了提高压裂效果，常常向其里面加入增稠剂，如魔芋胶。压裂工作结束后，需要降低压裂液的黏度，以方便其返排到地面。降低压裂液黏度的关键是破胶，生物酶破胶剂高效、环保，所以开发高效的、新型的生物酶破胶剂是当前石油开采中需要解决的重要问题之一。

β- 甘露聚糖酶可以酶解魔芋胶等压裂液增稠剂，作为生物酶破胶剂具有化学破胶剂无法比拟的优越性；本文对降解魔芋胶产β- 甘露聚糖酶的菌株进行物理和化学诱变，提高其产酶的活性，为油田生物酶破胶剂的开发和生产提供高效的酶。

1 实验部分

1.1 出发菌株主要试剂及培养基

东北林业大学微生物及免疫学实验室保存菌株Bacillus subtilis K。Bacillus subtilis K 经研究发现可以降解魔芋胶产β- 甘露聚糖酶[1]。

魔芋胶（成都路特实业有限公司）；甲基磺酸乙酯（EMS）（Sigma 公司）。

魔芋胶产酶培养基：魔芋胶30g·L-1，酵母膏5g·

L-1，NaCl 4g·L-1，KNO36g·L-1，K2HPO45g·L-1，MgSO4·7H2O 0.2g·L-1，pH 值为8.0。

魔芋胶初筛培养基：魔芋胶3g·L-1，CaCl20.5g·L-1，

KH2PO40.05g·L-1，NaCl 0.8g·L-1，MgSO4·7H2O 0.025g·L-1，KNO30.7g·L-1，酵母膏2g·L-1，蛋白胨5g·L-1，琼脂18g·L-1，pH7.0。

1.2 实验方法

1.2.1 出发菌株生长曲线的测定 取灭菌的牙签挑取适量菌体接入LB 培养基中，37℃150～160r·min-1，培养约12h。取种子液1mL 移入到50mL LB液体培养基中，37℃150～160r·min-1培养。间隔2h取样测菌液的OD600 值，绘制生长曲线。每次测量取3 组平行。

1.2.2 DNS 测定β- 甘露聚糖酶活力 采用改进的3,5- 二硝基水杨酸法（DNS 方法）测定酶活力。利用比色法测定酶解后还原产物的生成量，以表示酶的活力。

酶活力定义：在一定温度和pH 值条件下，以每分钟生成相当于1μmol D- 甘露糖所需酶量为一个酶活力单位（IU）。

1.2.3 出发菌株产酶历程的测定 取灭菌的牙签挑取适量菌体接入LB 培养基中，37℃150～160r·min-1，培养12h 左右。将600μL 种子液移入到魔芋胶产酶培养基中，37℃150～160 r·min-1培养。间隔2h 取样，用DNS 方法测定发酵液中酶的活性。每次测量取3 组平行。

1.2.4 紫外诱变育种

1.2.4.1 菌悬液的制备 挑取菌体接种于LB 液体培养基中，培养菌种达到对数生长期的后期，8000r·min-1离心5min，用生理盐水洗涤菌体3 次。利用紫外分光光度计在600nm 波长下，测定OD 值，用生理盐水配制成20mL 菌悬液，调整菌悬液中菌体浓度为108cfu·mL-1。

1.2.4.2 诱变处理 首先开启紫外灯（20W）预热20min。取4mL 制备好的菌悬液移入无菌培养皿中。将其置于磁力搅拌器上，放入无菌磁力搅拌棒，在20W 的紫外灯下，25cm 处进行照射。照射1min 后打开培养皿盖，边搅拌边照射，剂量分别为0，10，15，20，25，30，35，40，45，50s。可以累积照射也可以分别照射，为了防止光复活，全部无菌操作必须在红灯下进行。

用无菌生理盐水以10-1-10-6 稀释度稀释诱变菌液和未诱变菌液，分别取10-5，10-6 浓度菌液（包括诱变菌液和未诱变菌液）涂布于LB 固体平板培养基上，37℃倒置培养过夜，计算致死率，致死率=（对照菌液的活菌数－处理菌液的活菌数）/对照菌液的活菌数×100%。

1.2.4.3 诱变菌株的筛选 随机选取120 个诱变后的菌株点种在魔芋胶初筛培养基上，37℃倒置培养过夜。首先测量单菌落直径，再加入刚果红染液染色，静置5min，弃掉刚果红溶液，用自来水缓慢冲洗平板，测量透明水解圈直径，计算H/C（水解圈直径/菌落直径）比值。选择H/C 比值高的菌株进行DNS方法复筛。

1.2.4.4 诱变菌株遗传稳定性研究 对酶活性最高的菌株进行7 代的传代培养，测定各代β- 甘露聚糖酶的活性。

1.2.5 甲基磺酸乙酯诱变育种 选择紫外诱变活性最高的菌株进行甲基磺酸乙酯诱变。

1.2.5.1 菌悬液的制备 挑取菌体接种于LB 液体培养基中，培养菌种达到对数生长期的后期，8000r·min-1离心5min，用磷酸缓冲溶液洗涤菌体3 次。利用紫外分光光度计在600nm 波长下，测定OD 值，用磷酸缓冲溶液配制成20mL 菌悬液，调整菌悬液中菌体浓度为108cfu·mL-1。

1.2.5.2 诱变处理 取4mL EMS 母液，加入到16mL 的菌悬液中。处理最终浓度是1%（体积分数），分装到6 个离心管中，每管3mL。混匀后置于恒温振荡箱中，37℃，220r·min-1分别振荡处理5，10，15，20，25，30min 后，每管立即加入0.15mL 25%硫代硫酸钠（Na2S2O3）溶液终止反应。

用无菌生理盐水稀释诱变菌液和未诱变菌液，稀释梯度从10-1-10-6，分别取10-5，10-6 浓度菌液（包括诱变菌液和未诱变菌液）涂布于LB 固体平板培养基上，37℃倒置培养过夜，计算致死率。致死率=（对照菌液的活菌数－处理菌液的活菌数）/对照菌液的活菌数×100%。1.2.5.3 诱变菌株的筛选方法同1.2.3.3。

1.2.5.4 诱变菌株遗传稳定性研究方法同1.2.3.4。

2 结果与分析

2.1 出发菌株的生长曲线

以时间为横坐标，OD600为纵坐标绘制生长曲线。

图1 Bacillus subtilis K 生长曲线Fig.1 Growth curve of Bacillus subtilis K

由图1 中可以看出，培养时间增加，菌体数量也逐渐增加，当培养菌体13h 时数量达到最大值，之后随时间增加菌体数量呈下降趋势，所以紫外诱变和甲基磺酸乙酯诱变时菌体的培养时间确定为13h。

2.2 出发菌株的产酶历程

出发菌株的产酶历程见图2。

发酵产酶培养初期产酶量较少，在发酵培养11h 的时候酶活性达到最大值，所以发酵产酶时间确定为11h。

图2 Bacillus subtilis K 的产酶历程Fig.2 Enzyme production process of Bacillus subtilis K

2.3 紫外诱变结果和遗传稳定性

2.3.1 紫外诱变的致死率 出发菌株的紫外诱变致死率结果见图3。

图3 Bacillus subtilis K 紫外诱变致死率Fig.3 Ultraviolet mutagenesis fatality rate of Bacillus subtilis K

由诱变剂量的选择原则可知，当紫外诱变致死率为70%～80%时候，正突变率最高，所以紫外照射时间选为30～40s。

2.3.2 初筛和复筛结果 诱变菌株经刚果红染色，测量水解圈直径和菌落直径后，计算H/C（水解圈直径/菌落直径）的比值，选择比值大的菌株进行DNS方法的复筛。因为菌落直径大，表明该环境有利于菌体的生长。与对照组相比，选择20 株正突变菌株，进行DNS 复筛，最终获得酶活最高的正突变菌株为Bacillus subtilis K116，酶活力为3656.68U·mL-1，其出发菌株酶活力为3208.45U·mL-1，紫外诱变使酶活力提高了13.97%。

2.3.3 遗传稳定性 B.subtilis K116 连续培养7 代，菌株的酶活力见图4。

图4 B.subtilis K116 的遗传稳定性Fig.4 Genetic stability of B. subtilis K116

从图4 可见，突变菌株遗传稳定性良好，可用于后续研究。

2.4 甲基磺酸乙酯诱变结果和遗传稳定性

2.4.1 甲基磺酸乙酯诱变致死率 甲基磺酸乙酯属于化学诱变剂，本文中诱变剂浓度选为1%。甲基磺酸乙酯对B.subtilis K116 的致死率见图5。

图5 B.subtilis K116 甲基磺酸乙酯1%浓度诱变致死率Fig.5 Induced fatality rate of B. subtilis K116 under 1%ethylmethane sulfonate

当致死率应在70%～80%之间，正突变率最高，所以菌株K116 的甲基磺酸乙酯诱变时间选为10min。

2.4.2 初筛和复筛结果 在初筛平板上倒入刚果红溶液染色，测量水解圈直径和菌落直径，并计算H/C 比值，与对照组相比，分别选择20 株正突变菌株，进行复筛。

测定初筛所得的20 株突变株，最终得到的酶活最高的突变菌株B.subtilis KL-116，酶活力为3801.85U·mL-1，甲基磺酸乙酯使酶活力提高了3.97%。

2.4.3 遗传稳定性 B.subtilis KL-116 连续传代7次，菌株的酶活见图6。

图6 B.subtilis KL-116 的遗传稳定性Fig.6 Genetic stability of B. subtilis KL-116

由图6 可以看出，菌株遗传稳定性良好，可用于后续研究。

3 讨论

微生物具有高效的生物转化能力，其产生的生物活性物质在医药、食品和化学工业中具有重要地位[2]。微生物的诱变育种一般采用物理诱变（如紫外线、X 射线等）和化学诱变（如碱基类似物、烷化剂甲基磺酸乙酯等）方法[3]。诱变育种方法是通过人为的诱变手段，改变微生物的遗传结构和功能，从众多变异的菌体中筛选出产量高、性状优良的突变株。该方法具有速度快、方法简单、效果明显等优点，是选育菌种的重要途径之一。

紫外线诱变的机制是由于紫外线辐射导致DNA 分子形成胸腺嘧啶二聚体，妨碍碱基正常配对，从而引起突变。甲基磺酸乙酯诱变的机制是使DNA 分子上的碱基及磷酸部分被烷化，DNA 复制时导致碱基配对错误而引起突变[4]。本研究利用紫外线和甲基磺酸乙酯诱变降解压裂液增稠剂的菌株，结果表明物理诱变效果好于化学诱变剂。

［1] 张婕,赵敏,卢磊,李慧玲.产β- 甘露聚糖酶细菌的筛选及产酶条件的优化［J].北京林业大学学报,2011,33（4）:96-101.

［2] Demain A L，Adrio J L.Contributions of microorganisms to industrial biology［J].Mol Biotechnol,2008,38:41-55．

［3] 许翠,高梦祥.微生物菌种诱变筛选方法及其应用［J].长江大学学报（自然科学版）,2013,35（10）:56-60.

［4] 李荣杰.微生物诱变育种方法研究进展［J].河北农业科学,2009,13（10）:73-76.