海藻糖标准样品的研制*

陈晖 ，方华 ，张怡评 ，陈伟珠 ，洪专 ，易瑞灶

(1.国家海洋局第三海洋研究所，福建厦门 361005；

2.厦门大学海洋与地球学院，近海海洋环境科学国家重点实验室，福建厦门 361005)

海藻糖是一种分子结构明确的天然二糖，由两个葡萄糖分子通过半缩醛羟基以α–1，1糖苷键结合，其二水合物分子式为C12H22O11·2H2O，相对分子质量为378.33。海藻糖无毒性，水溶性好，结构稳定。近年来，国内外的众多研究表明海藻糖具有保存生物活力的特殊功能，国际上用它作为生物活性物质的稳定剂和保护剂，在保护基因工程酶类、各种病毒、疫苗、抗体、蛋白质因子、核酸等方面都取得了很好的结果，在食品、保健品、化妆品、医药、分子生物化学和农业等领域显示了广阔的应用前景［1］。

目前国内外高度重视海藻糖在食品、生物医药等领域的开发利用，已有食用级海藻糖和药用辅料级海藻糖在市场上销售使用，但是国内未见海藻糖国家标准样品研制的报道及销售，使得国内对海藻糖产品的质量控制及药理药效学研究完全依赖于昂贵的进口标准样品［2］，限制了对海藻糖的深入研究。笔者以食品级海藻糖粗品为原料，纯化制备了海藻糖标准样品，解决了海洋天然活性物质中结构近似的糖类化合物难以分离的共性技术问题，对加速海藻糖活性的理论研究与应用基础研究、促进海洋生物医药的发展具有积极的推动作用。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

离 子 色 谱 仪：ICS 3000型，美 国Thermo Scientifi c公司；

红外光谱仪：VERTEX 70型，美国Bruker公司；质谱仪：3100型，美国Waters公司；

核磁共振仪：400 MHz，美国Bruker公司；

单晶衍射仪：SuperNova型，美国Agilent公司；天平：AL／104型，瑞士Mettler Toledo公司；纯水机：Milli-Q型，美国Milli-pore公司；

氢氧化钠溶液：质量分数为50%，美国Thermo Scientifi c公司。

1.2 海藻糖标准样品的制备

以食品级海藻糖粗品为原料，经热溶冷析结晶、乙醇结晶、减压干燥等方式获得纯度不低于99%的海藻糖。

1.3 定性分析

采用红外吸收光谱、质谱、核磁共振谱、单晶衍射等对海藻糖标准样品进行定性分析。

1.4 定值分析

海藻糖标准样品含量采用高灵敏度的离子色谱法［3］进行测定。

1.4.1 色谱条件

色谱柱：CarboPac PA–10柱(250 mm×4 mm，美国 Thermo Scientifi c)；流动相：30 mol／L NaOH溶液；流量：0.8 mL／min；积分安培检测器，标准4电位检测；进样体积：25 μL；柱温：30℃。

1.4.2 样品配制

精密称取海藻糖标准样品0.150 g，用水溶解并定容于100 mL容量瓶中，摇匀后精密移取1 mL至250 mL容量瓶中，定容，摇匀，用0.2 μm微孔滤膜过滤，按照1.4.1色谱条件进行纯度检测，进样25 μL。每个样品重复进样测定3 次。

1.5 均匀性检验

对同一批制备的海藻糖样品进行分装，每瓶净重为1 g，共400瓶。按照GB／T 15000.3–2008［4］规定，确定抽样数目为15个，采用单因素多水平试验方差分析法对海藻糖样品进行纯度均匀性检验，测定方法采用离子色谱法，每个样品重复测定3次。检测数据用方差分析法进行分析以判断标准样品的均匀性是否合格。

1.6 稳定性检验

取海藻糖样品模拟上市包装，在(40±2)℃，相对湿度为(75±5)%的条件下进行24个月长期试验，分别于 0，3，6，9，12，18，24 个月取样，采用离子色谱法进行检测，考察其样品纯度的变化。

2 结果与讨论

2.1 海藻糖标准样品的定性分析

利用红外吸收光谱、质谱、核磁共振谱以及单晶衍射对海藻糖标准样品进行定性分析。

图1、图2分别是海藻糖标准样品的红外光谱、质谱图。海藻糖标准样品的核磁解析数据见表1。

图1 海藻糖标准样品的红外光谱图

图2 海藻糖标准样品的质谱图

表1 海藻糖标准样品的核磁共振数据归属(D2O介质)

由图1可知，海藻糖结构中存在羟基(—OH)、亚甲基(—CH2)、碳与氧的单键连接。样品质谱图中，在负离子电喷雾状态下测得准分子离子峰为m／z 341［M–H］+，与其相对分子质量(342)相符。此外，在该质谱图中还可见到m／z 179(C6H11O6)和m／z 163(C6H11O5)的少量碎片，与该化合物为两个六碳糖相连而成的结构相符。

由表1可知，该化合物的各质子、各碳的化学位移与文献数据基本一致，且质子数、碳原子数与海藻糖的分子式一致。其中，端基质子δ5.08 (d，J=4.0 Hz)为耦合常数4.0 Hz的二重峰，属于D–葡萄糖的1位质子与2位质子呈e-a立体关系，表明为α立体构型。由于该分子呈完全对称的氢谱和碳谱数据，表明两个葡萄糖之间以α，α键相连而成［5］。

通过培养获得海藻糖单晶，选择大小适度、晶质良好的单晶体，利用X–衍射技术进行晶体的测定和数据分析，结果表明该化合物为2水合α，α–海藻糖，2分子椅式吡喃型D–葡萄糖均通过端基的α构型连接而成，与Liu W等［6］报道一致。

确定海藻糖的结构式(如图2所示)及晶体结构。

图2 海藻糖的结构式

2.2 均匀性检验

在对海藻糖标准样品进行分装后，进行纯度均匀性检验，均匀性检验结果见表2、表3。

表2 海藻糖标准样品纯度均匀性检验结果 %

表3 均匀性检验方差分析结果

由表 3 可知，F=MS组间／MS组内≈ 1.84，F(0.05，14，30)=2.04，F＜F(0.05，14，30)，说明在 95% 的置信区间，海藻糖标准样品均匀性良好。

2.3 稳定性检验

因为海藻糖性质稳定，所以选择在高温条件下加速样品的化学或物理变化，模拟出样品在长期储存条件下的变化，考察样品的稳定性，为样品的包装、运输、存储提供资料。在40℃条件下24个月内海藻糖标准样品测定结果见表4。

表4 海藻糖标准样品稳定性检验结果

采用直线模型作为经验模型，对海藻糖长期稳定性获得的数据进行分析［7–8］，计算可得斜率|a|＜t0.95，n-2s(a)，故斜率不显著，因而未观测到不稳定性，说明在该存储条件下，海藻糖标准样品稳定性良好。参照中国药典(2010版)［9］的相关说明，可以将海藻糖标准样品的有效期暂定为2年。

2.4 定值结果及其不确定度评定

2.4.1 定值结果

按照GB／T 15000.3–2008标准要求，采用多个实验室协作定值，选择获得国家或部门认可、具备资质的8家实验室对研制的海藻糖标准样品进行定值。随机抽取8瓶样品，每个定值实验室送1瓶，采用离子色谱法进行测定，应用面积归一法进行定量，定值结果见表5。

表5 海藻糖标准样品定值结果汇总 %

汇集各家实验室的检测数据后，对每家实验室的数据按大小顺序排列，用Grubb’s法和峰度法正态性检验组内数据的异常值，结果没有异常值，则所有数据进行下一步统计［10］。再用Grubb’s法对每家实验室的平均值进行检验，将其看成一组测定值进行异常值检验，结果无异常值。因此将各家实验室测得的数据作为无偏估计值，计算8家实验室测定结果的平均值及标准偏差。然后对各实验室测定结果的标准偏差s进行Cochran检验，按式(1)计算统计量C：

式中：si——各实验室测定结果的标准偏差；

smax——si中的最大值。

计算 得 C=0.685，查表得 C8，6(0.05)=0.360，C ＞C8，6(0.05)，表明各实验室间的测量不属于等精度测量，因此计算加权平均值作为最佳值得到海藻糖标准样品的定值结果(总平均值X=99.72%)。

2.4.2 定值结果的不确定度评定

根据GB／T 15000.3–2008标准规定，定值结果由标准值和不确定度组成。标准样品特性标准值的测量不确定度u由标准值定值试验的不确定度u(X)、均匀性检验的不确定度ubb和稳定性检验的不确定度ults组成。依据全部测定结果，计算海藻糖样品的特性标准值和不确定度。

(1)标准值定值试验引入的不确定度u(X)。按照加权法计算得到标准样品定值的不确定度u(X)=0.08%。

(2)均匀性检验引入的不确定度ubb。该项用瓶间方差表示，计算得ubb=0.02%。

(3)稳定性检验引入的不确定度ults。由2.3稳定性试验可以计算得ults=s(a)t=0.09%。

则标准样品定值的不确定度：取包含因子k=1.96，则扩展不确定度：U95=ku=1.96×0.13%=0.26%

海藻糖标准样品定值结果为(99.72±0.26)%，k=1.96。

3 结语

研制的海藻糖标准样品经实验考察其均匀性、稳定性均符合要求，该标准样品对食品安全、生物医药等方面的测量和科学研究提供了技术支撑和量值溯源保证。

［1］ 马文锦，刘树兴，潘巨忠，等.海藻糖的生产制备及应用前景［J］.现代农业科技，2007，24: 199–201.

［2］ 汪斌，卢晓华，孟凡敏.2001年以来我国标准物质发展状况概述［J］.江苏现代计量，2009(5): 34–36.

［3］ 陈晖，易瑞灶，谢荣伟，等.基于离子色谱法的海藻糖检测方法研究［J］.中国海洋药物，2012(1): 34–37.

［4］ GB／T 15000.3–2008 标准样品工作导则(3) 标准样品定值的一般原则和统计方法［S］.

［5］ 田媛，张尊建.糖类结构的核磁共振波谱及质谱分析［J］.药学进展，2003(2): 78–80.

［6］ Liu W，Yan J，Song Q，et al.Trehalose dihydrate from Tremella fuciformis［J］.Acta Crystallographica Section E Structure Reports Online，2012，68(8): 2 511.

［7］ 刘德富.药品稳定性试验的统计分析［J］.中国医药工业杂志，1993，24(4): 185–188.

［8］ 王弘，刘皈阳，张燕平.药品稳定性实验研究进展［J］.中国新药杂志，2006，20: 1 710–1 715.

［9］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典2010版［M］.二部.附录199–201.北京：中国医药科技出版社，2010.

［10］ 陈伟珠，谢全灵，张怡评，等.4，9–脱水河豚毒素国家标准样品的研制［J］.化学分析计量，2014，23(3): 1–4.