牛乳源金黄色葡萄球菌黏附素分子FnBPA不同功能区生物学活性的比较分析

邵俊高，张宝江，李善春，王彩蝶，王国勤，苏 艳

(新疆农业大学 动物医学学院，乌鲁木齐 830052)

牛乳源金黄色葡萄球菌黏附素分子FnBPA不同功能区生物学活性的比较分析

邵俊高，张宝江，李善春，王彩蝶，王国勤，苏 艳*

(新疆农业大学 动物医学学院，乌鲁木齐 830052)

旨在研究和比较牛乳源金黄色葡萄球菌黏附素分子A区(FnBPA-A)和BCD区(FnBPA-BCD)两个功能区重组蛋白质免疫后的生物学功能，并评价其作为抗原开展研制抗金黄色葡萄球菌疫苗的价值。利用原核表达载体pET-28a分别表达重组蛋白质FnBPA-A与FnBPA-BCD，比较二者的黏附特性，并用纯化后的重组蛋白质单独及联合免疫方式免疫新西兰白兔和小鼠，分析比较各组蛋白质诱导的特异性抗体抑制菌体及对纤维蛋白原(Fg)、纤维连接素(Fn)的结合能力，免疫小鼠抗体水平及对小鼠的免疫保护力。结果表明，两种重组蛋白质具有不同的黏附活性，联合免疫组产生的特异性抗体水平及与Fg、Fn的结合能力均较单独免疫组高。重组蛋白质FnBPA的A区及两种蛋白质联合免疫组特异性抗体水平，抗血清对金黄色葡萄球菌Fg，Fn黏附的抑制能力要优于BCD区。免疫小鼠攻毒结果显示各免疫组均对小鼠有良好的保护效果，其中FnBPA的A区蛋白质免疫保护率高于其他试验组。该研究的结果可为牛源金黄色葡萄球菌性的乳腺炎新型疫苗的优化设计与合理应用提供依据。

金黄色葡萄球菌；FnBPA-A；FnBPA-BCD；生物学活性

黏附素是金黄色葡萄球菌表面表达的特异性蛋白质，可促进金黄色葡萄球菌与宿主细胞、细胞外基质和可溶血浆蛋白的黏附，有助于该菌对宿主组织的侵入、定植和扩散，是金黄色葡萄球菌感染的重要一步[1-2]。几乎所有的金黄色葡萄球菌都拥有FnBPA[3]，该蛋白质已成为抗金黄色葡萄球菌感染疫苗开发的热点分子[4]。 FnBPA蛋白有4个功能区，其中A区与D区最受关注：A区可介导细菌和纤维蛋白原(Fibrinogen，Fg)的结合[5-6]；D区也称配基结合区，可介导细菌和纤连蛋白(Fibronectin，Fn)的结合[7]。研究表明 FnBPA 的免疫决定表位位于D区[8]。比较FnBPA的A区和D区片段表达蛋白质的免疫原性，分析认为D区蛋白质的免疫特性优于A区蛋白质[9]。杨宏军等扩增了FnBPA的A区进行亚单位疫苗的研制，亚单位疫苗的免疫效果较好[10]。赵艳等对FnBPA的D区进行了原核表达与分析，结果表明D区蛋白的抗体具有抗该菌黏附的作用[11]。对位于FnBPA蛋白不同功能区免疫后的抗黏附和免疫保护特性的比较分析还未见报道。本研究在对来自于牛乳源金黄色葡萄球菌FnBPA基因A区和BCD区表达的基础上将纯化后的重组蛋白质免疫新西兰白兔和C57BL/6小鼠，旨在比较和分析这两种重组蛋白质免疫生物学功能及免疫保护力的差异，为今后开展金黄色葡萄球菌性乳腺炎的免疫和防控提供资料。

1 材料与方法

1.1 菌种、试剂及实验动物

奶牛乳源金黄色葡萄球菌分离株GY309，由新疆农业大学动物医学学院微生物实验室分离鉴定并保存。原核表达载体pET-28a(+)、大肠杆菌BL21(DE3)均为本实验室保存，重组质粒pMD18-T-309FnBPA质粒为本实验室构建并保存。

限制性内切酶EcoRI、XhoI，DNA聚合酶，T4连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司；Ni-NTA Resin购自Transgen公司；HRP-IgG购自中杉金桥公司；Fibrinogen、 Fibronectin购自Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。

2.5 kg雌性SPF级新西兰大白兔，18～20 g雌性C57BL/6小鼠，均购自新疆维吾尔自治区实验动物研究中心。

1.2 目的片段扩增

根据pMD18-T-309FnBPA测序结果，用Oligo 7.0设计2对原核表达引物。F1：5′-GCGGAATTCACTAACGTTAATCATAT-3′(EcoRI酶切位点)；R1：5′-TATTCTCGAGTTTCAATGTATCCGTC-3′(XhoI酶切位点)；F2：5′-GCGGAATTCGAGGAATCAAATCCAATT-3′(EcoRI酶切位点)，R2：5′-TATTCTCGAGTTGTATCTTCTTCAATCG-3′(XhoI酶切位点)。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

以pMD18-T-309FnBPA质粒为模板，PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s；58 ℃退火1 min；72 ℃延伸90 s，38个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.3 原核表达载体重组表达质粒的构建

将FnBPA-A基因和FnBPA-BCD基因用EcoRI和XhoI双酶切后，与经相应酶切的pET-28a(+)载体进行连接，获得重组表达质粒pET-28a-FnBPA-A和pET-28a-FnBPA-BCD。经PCR、酶切鉴定正确，送上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.4 重组蛋白质的诱导表达、纯化

将鉴定正确的重组表达质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选后接种至50 μg·mL-1卡那霉素的LB液体培养基，37 ℃ 200 r·min-1振荡培养至OD600 nm达到0.4时，加入终浓度为1 mmol·L-1IPTG进行诱导。取10 μL样品进行SDS-PAGE电泳检测目的蛋白质。收集的菌体经超声破碎后，利用Ni层析柱对重组目的蛋白质进行纯化，-80 ℃保存备用。

1.5 重组蛋白质Western blot分析

将重组蛋白质FnBPA-A和FnBPA-BCD样品各10 μL进行SDS-PAGE电泳后，湿法电转移至硝酸纤维素膜上(300 mA，1 h)，以兔抗金黄色葡萄球菌抗血清为一抗(1∶4 000)，以HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶30 000)作为二抗，使用DAB显色，水洗照相。

1.6 重组蛋白质对纤维蛋白原(Fg)与纤连蛋白(Fn)的识别能力研究

采用ELISA法测定重组蛋白质对Fg和Fn的识别能力。分别用每孔100 μL(50 ng)的Fg和Fn包被酶标板，5%脱脂奶粉封闭后，每孔加入20 ng重组蛋白质，加入1∶6 000倍稀释的兔抗金黄色葡萄球菌全菌抗血清为一抗，1∶8 000稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG为酶标二抗，TMB溶液为显色液，测OD450 nm值。

1.7 重组蛋白质免疫试验兔

8只新西兰大白兔随机分为4组，每组2只，分别为FnBPA-A重组蛋白质免疫组、FnBPA-BCD重组蛋白质免疫组、两种重组蛋白质联合免疫组和空白对照组。免疫剂量为每只200 μg，首次免疫与等体积的弗氏完全佐剂乳化，第二次免疫时重组蛋白质与弗氏不完全佐剂等体积混合。采取背部皮下注射免疫。空白对照组注射等体积的生理盐水，免疫时间间隔为21 d。首次免疫后第0天、第14天和第28天兔耳中动脉采血，分离血清，检测血清特异性抗体。

1.8 免疫兔血清抑制金黄色葡萄球菌与Fg和Fn黏附的检测

分别用Fg(5 μg·mL-1) 100 μL 和Fn(6.25 μg·mL-1) 100 μL包被酶标板。5%脱脂奶粉37 ℃封闭2 h，将对数生长期的金黄色葡萄球菌稀释到OD600 nm=1.0与等体积1∶50倍稀释的蛋白质抗血清于37 ℃孵育60 min。将孵育后金黄色葡萄球菌加入到封闭后的酶标板中，以未经孵育的金黄色葡萄球菌作为对照，37 ℃作用2 h，PBST洗涤5次。30%甲醛溶液固定30 min，PBST洗涤5次。结晶紫染色10 min，PBST洗涤5次。用95%乙醇洗涤3次后测定OD450 nm值。

1.9 重组蛋白质免疫小鼠及小鼠血清抗体效价的检测

24只雌性C57BL/6小鼠随机分为4组，每组6只，分别为FnBPA-A重组蛋白质免疫组，FnBPA-BCD重组蛋白质免疫组、FnBPA-A+FnBPA-BCD重组蛋白质联合免疫组和PBS对照组，按50 μg·只-1皮下注射免疫，免疫程序同上，进行2次免疫。首次免疫后第0天、第14天和第28天采血，分离血清-20 ℃保存备用。

采用间接ELISA法测定重组蛋白质抗体水平。用每孔100 μL(100 ng)重组蛋白质(FnBPA-A、FnBPA-BCD各50 ng)包被酶标板，加入100 μL稀释后的待检血清(1∶300)，以1∶8 000稀释的HRP标记山羊抗鼠IgG为二抗，TMB溶液显色，测OD450 nm值。

1.10 小鼠攻毒试验

首次免疫后第76天，取金黄色葡萄球菌接种于BHI培养基，37 ℃培养，以最小致死量2×109CFU(1MLD)，分别对FnBPA-A免疫组、FnBPA-BCD免疫组、FnBPA-A+FnBPA-BCD免疫组和PBS对照组各小鼠进行攻毒，攻毒后一周内连续观察，并记录小鼠死亡情况。

2 结 果

2.1 FnBPA-A和FnBPA-BCD重组表达质粒的鉴定

重组质粒pET28a-FnBPA-A经双酶切后，获得约为5 300和1 500 bp的条带，重组质粒pET28a-FnBPA-BCD经双酶切后，获得约为5 300和800 bp的条带，与理论值相符(图1A和图1B)，证明构建的重组质粒均含有目的基因。

M.DNA相对分子质量标准；1.重组质粒的EcoRI、XhoI双酶切产物；2.空白质粒的EcoRI、XhoI双酶切产物；3.PCR扩增的FnBPA-A(A)或FnBPA-BCD(B)基因M.DNA molecular weight marker；1.Digestion of recombinant plasmid by EcoRI and XhoI；2.Digestion of pET28a(+) by EcoRI and XhoI；3.PCR product of FnBPA-A (A) or FnBPA-BCD (B) gene图1 pET28a-FnBPA-A(A)和pET28a-FnBPA-BCD(B)重组质粒的构建与鉴定Fig.1 Construction and identification of the recombinant expression plasmid pET28a-FnBPA-A (A) and pET28a-FnBPA-BCD (B)

2.2 重组蛋白质的诱导表达和纯化

重组菌经诱导表达后进行 SDS-PAGE 电泳，重组蛋白质FnBPA-A在70 ku出现条带(图2A)，重组蛋白质FnBPA-BCD在50 ku处出现明显的条带(图2B)，与预期理论值相符，表明重组目的蛋白质成功表达。

2.3 重组蛋白质的 Western blot分析结果

以金黄色葡萄球菌全菌免疫兔抗血清分别与这两种重组蛋白质反应，Western blot分析结果显示，FnBPA-A蛋白在70 ku处出现条带(图3A)，FnBPA-BCD蛋白在50 ku处出现条带(图3B)，说明两种重组蛋白质可以与全菌免疫兔血清发生特异性的反应。

M.蛋白质相对分子质量标准；1.FnBPA-A(A)或FnBPA-BCD(B)重组蛋白质M.Protein molecular weight marker；1.FnBPA-A (A) or FnBPA-BCD (B) protein图3 重组蛋白质 FnBPA-A(A)和FnBPA-BCD(B)的Western blot鉴定Fig.3 Western blot analysis of FnBPA-A (A) and FnBPA-BCD (B) protein

2.4 重组蛋白质FnBPA-A及FnBPA-BCD对纤维蛋白原(Fg)与纤连蛋白(Fn)黏附活性

FnBPA不同功能区的重组蛋白对Fg和Fn结合能力的检测结果表明(图4)，重组蛋白质FnBPA-A对Fg结合高于FnBPA-BCD(P<0.01)(图4A)；FnBPA-BCD重组蛋白质对Fn结合高于FnBPA-A(P<0.01)(图4B)。

A.重组蛋白质对Fg结合检测结果；B.重组蛋白质对Fn结合的检测结果。与对照组相比，＊.P<0.05；＊＊.P<0.01。下图同A.Binding activity of the recombinant proteins with fibrinogen；B.Binding activity of the recombinant proteins with fibronectin.Compared with the control group，＊.P<0.05；＊＊.P<0.01.The same as below图4 FnbPA-A及FnBPA-BCD重组蛋白质对纤维蛋白原(Fg)与纤连蛋白(Fn)黏附活性比较Fig.4 Comparison binding activity of the recombinant proteins to fibrinogen and fibronectin

2.5 重组蛋白质免疫血清抑制金黄色葡萄球菌与Fg和Fn黏附的检测

分别以兔不同免疫组抗血清和金黄色葡萄球菌进行作用，比较不同组抗血清抑制金黄色葡萄球菌与Fg、Fn结合能力。黏附抑制的结果表明，FnBPA-A免疫组抗血清抑制金黄色葡萄球菌与Fg黏附的效果优于FnBPA-BCD免疫组(P<0.01)(图5A)，FnBPA-BCD免疫组抗血清抑制金黄色葡萄球菌与Fn黏附的效果优于FnBPA-A免疫组(P<0.01)(图5B)，联合免疫组抗血清抑制金黄色葡萄球菌与Fg和Fn黏附的能力显著强于单独免疫组(P<0.05或P<0.01)(图5)。

A.抗血清抑制金黄色葡萄球菌对Fg的黏附；B.抗血清抑制金黄色葡萄球菌对Fn的黏附A.Anti-adherence assays of the serums with fibrinogen；B.Anti-adherence assays of the serums with fibronectin图5 重组蛋白质FnBPA-A、FnBPA-BCD和联合免疫组抗血清对金黄色葡萄球菌的黏附抑制Fig.5 Anti-adherence assays of the serums to fibrinogen and fibronectin

2.6 小鼠免疫后抗体水平检测

采用间接ELISA方法分别对4组首免前、首免后第14天和首免后第28天的小鼠免疫抗血清进行抗体效价的检测。与免疫前相比不同组在免疫后抗体效价均有明显提高，随着免疫时间推移，抗体效价逐渐上升，且在第二次免疫后抗体效价达到高峰(图6A)。其中FnBPA-A免疫组与FnBPA-A+FnBPA-BCD免疫组的效价相近，均高于FnBPA-BCD免疫组与空白对照组(图6B)。

A.鼠免疫重组蛋白质后血清效价消长变化；B.鼠免疫后血清抗体滴度A.Titeration of antibody against FnBPA-A and FnBPA-BCD in blood serum of immunized mice；B.Determination of serum antibody titers against FnBPA-A and FnBPA-BCD of immunized mice图6 鼠免疫重组蛋白质FnBPA-A和FnBPA-BCD后血清效价消长变化和血清抗体滴度Fig.6 Titeration and change of antibody against FnBPA-A and FnBPA-BCD in serum of immunized mice

2.7 免疫小鼠的免疫保护力试验

初次免疫后第76天，选取牛源金黄色葡萄球菌GY309分离株 (攻毒剂量1MLD)攻毒，观察小鼠死亡情况。结果显示，攻毒后72 h，对照组全部死亡，FnBPA-A免疫组的保护率为83.3%，FnBPA-BCD免疫组的保护率为50%，联合免疫组的保护率为66.7%。试验结果显示各免疫组对金黄色葡萄球菌的攻击均具有一定保护效果，FnBPA-A免疫组的免疫保护效果优于FnBPA-BCD免疫组。

3 讨 论

以往通过对金黄色葡萄球菌感染机体过程的研究，发现该菌的黏附蛋白与哺乳动物上皮细胞外基质黏附能力的大小可直接影响其致病力[12]。黏附和定植是金黄色葡萄球菌感染寄主细胞的首要条件[4]。以往的研究对FnBPs蛋白的研究多集中于D区[9，11，13]。鉴于FnBPA的A区和BCD区在黏附过程中分别结合宿主细胞表面的Fg和Fn分子，为实现对该菌感染的有效控制，有必要对该分子的不同功能区分别表达，进而比较二者在免疫原性、抗体的抗黏附能力及免疫保护力等方面的差异。

研究表明，不同地区流行菌株FnBPA-A具有其各自的特点[14]。目前的研究发现具有Fn结合能力的D区产生的抗体绝大多数不能和FnbpA无定型的重复序列结合，只有当无定型的重复序列与Fn结合后，该抗体才能与其结合，因此D区产生的抗体不能有效地阻断细菌的侵入，这对免疫保护来说是不利的。此外D区片段过小，并且没有固定的二级结构[6，15]。因此对于动物机体的免疫保护来说，需要重新评估D区的作用。

本研究将纯化后的重组蛋白质分别结合Fg和Fn分子，重组蛋白质FnBPA的A区结合Fg的能力要优于 BCD区，重组蛋白质FnBPA的BCD区对Fn的结合能力优于A区。这一点与以往的关于FnBPA不同功能区黏附特性的研究结果一致[5，7]。

重组蛋白质免疫兔抗体在抑制金黄色葡萄球菌与Fg和Fn的黏附的检测结果表明，重组蛋白质FnBPA的A区及两种蛋白质联合免疫组抗血清对金黄色葡萄球菌Fg黏附的抑制能力要优于BCD区。重组蛋白质FnBPA的BCD区及两种蛋白质联合免疫组抗血清对金黄色葡萄球菌黏附Fn的抑制能力要优于A区。M.C.Gaudreau等也证明在金黄色葡萄球菌ClfA DNA疫苗免疫小鼠后抗体可抑制细菌对Fg的黏附[16]。

免疫小鼠的抗体检测结果显示，重组蛋白质FnBPA的A区诱导抗体的能力略优于BCD区，这与何焱等[9]用D区蛋白质免疫后得出D区蛋白质的免疫效果优于A区蛋白质不完全一致，分析原因可能与我们表达的BCD区蛋白质大小与其表达的D区不完全相同有关。

综合本试验的结果可以得出，FnBPA的A区重组蛋白质在诱导抗体的水平、其诱导的抗体抑制金黄色葡萄球菌与Fg的黏附及其免疫后对免疫小鼠的保护力方面均优于BCD区。联合免疫组虽在诱导小鼠抗体水平和抑制金黄色葡萄球菌与Fg和Fn黏附方面优于A区和BCD区重组蛋白质单独免疫组，但对免疫小鼠的保护力方面却低于FnBPA的A区单独免疫组。分析可能存在两方面的原因，一是因为免疫保护效果并不是抗体水平的简单叠加，即使联合免疫组总的抗体水平高，其免疫保护力不一定高；其次可能是在联合免疫过程中免疫原之间存在着免疫干扰。

FnBPA的A区的免疫保护性不应当被忽视，应当被当作有潜力的奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌亚单位疫苗的候选区域，且A区片段较大，二级结构稳定，适合做免疫原。

[1] LAMMERS A，NUIJTEN P J，KRUIJT E，et al.Cell tropism ofStaphylococcusaureusin bovine mammary gland cell cultures[J].VetMicrobiol，1999，67(2)：77-89.

[2] 陈怀青，陆承平.金黄色葡萄球菌的粘附素[J].中国人兽共患病杂志，1996，12(6)：43-44. CHEN H Q，LU C P.The adhesins ofStaphylococcusaureus[J].ChineseJournalofZoonoses，1996，12(6)：43-44.(in Chinese)

[3] 周 宏，李韩平，姜永强，等.金黄色葡萄球菌表面蛋白研究进展[J].生物技术通讯，2004，15(1)：73-75. ZHOU H，LI H P，JIANG Y Q，et al.The progress ofStaphylococcusaureussurface proteins[J].LettersinBiotechnology，2004，15(1)：73-75.(in Chinese)

[4] 任士飞，徐建生，董国雄，等.细菌黏附研究进展[J].中国预防兽医学报，2004，26(3)：238-240. REN S F，XU J S，DONG G X，et al.Progress in research of bacterial adherence[J].ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine，2004，26(3)：238-240.(in Chinese)

[5] KEANE F M，LOUGHMAN A，VALTULINA V，et al.Fibrinogen and elastin bind to the same region within the A domain of fibronection binding protein A，an MSCRAMM ofStaphylococcusaureus[J].MolMicrobiol，2007，63(3)：711-723.

[6] LOUGHMAN A，SWEENEY T，KEANE F M，et al.Sequence diversity in the A domain ofStaphylococcusaureusfibronectin-binding protein A[J].BMCMicrobiol，2008，8：74.

[7] CASOLINI F，VISAI L，JOH D，et al.Antibody response to fibronectin-binding adhesin FnbpA in patients withStaphylococcusaureusinfections[J].InfectImmun，1998，66(11)：5433-5442.

[8] JOH H J，HOURSE P K，PATTI J M，et al.Fibronectin receptors from Gram-positive bacteria：comparison of active sites[J].Biochemistry，1994，33(20)：6086-6092.

[9] 何 焱，谢红霞，杨 岚，等.牛源金黄色葡萄球菌FnBPA A基因与D基因表达产物的免疫原性比较[J].中国兽医科学，2014，44(5)：480-484. HE Y，XIE H X，YANG L，et al.Comparison of immunogenicity between the expressed proteins of FnBP A gene and D gene ofStaphylococcusaureusfrom cattle[J].ChineseVeterinaryScience，2014，44(5)：480-484.(in Chinese)

[10] 杨宏军，高运东，王长法，等.金黄色葡萄球菌粘附素Fnbp A功能区基因的克隆和原核表达[J].西北农林科技大学学报：自然科学版，2008，36(1)：54-58. YANG H J，GAO Y D，WANG C F，et al.Cloning and expression of the functional Fnbp A gene ofStaphylococcusaureusadhesin[J].JournalofNorthwestA&FUniversity(NaturalScienceEdition)，2008，36(1)：54-58.(in Chinese)

[11] 赵 艳，张爱荣，郝永清.金黄色葡萄球菌的FnBPA D基因片段的表达[J].中国预防兽医学报，2009，31(5)：361-365. ZHAO Y，ZHANG A R，HAO Y Q.Cloning and expression of the D fragment of fibronectin-binding protein A gene fromStaphylococcusaureus[J].ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine，2009，31(5)：361-365.(in Chinese)

[12] BROUILLETTE E，LACASSE P，SHKRETA L，et al.DNA immunization against the clumping factor A (ClfA) ofStaphylococcusaureus[J].Vaccine，2002，20(17-18)：2348-2357.

[13] 史冬艳，郝永清，张爱荣.奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌FnbpB-D基因的表达及其抗血清活性[J].中国预防兽医学报，2010，32(5)：356-359. SHI D Y，HAO Y Q，ZHANG A R.Expression of fibronectin-binding protein B (FnbpB) region D ofStaphylococcusaureusand antiserum activity[J].ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine，2010，32(5)：356-359.(in Chinese)

[14] 张向新，石庆华，王世民，等.新疆奶牛乳腺炎致病性金黄色葡萄球菌FnbpA 基因的克隆与序列分析[J].新疆农业大学学报，2010，33(5)：422-426. ZHANG X X，SHI Q H，WANG S M，et al.Clone and sequence analysis of FnbpA gene of Staphylococcusaureusisolated from Xinjiang dairy cow with subclinical Mastitis[J].JournalofXinjiangAgriculturalUniversity，2010，33(5)：422-426.(in Chinese)

[15] 范 鑫，郝永清，张爱荣，等.金黄色葡萄球菌黏附素FnBPB-ClFA共表达质粒的构建与原核表达[J].中国兽医科学，2011，41(2)：173-177. FAN X，HAO Y Q，ZHANG A R，et al.Construction and prokaryotic expression of the co-expression plasmid with FnBPB-ClFA gene encodingStaphylococcusaureusadhesion[J].ChineseVeterinaryScience，2011，41(2)：173-177.(in Chinese)

[16] GAUDREAU M C，LACASSE P，TALBOT B G.Protective immune responses to a multi-gene DNA vaccine againstStaphylococcusaureus[J].Vaccine，2007，25(5)：814-824.

(编辑 白永平)

Comparison and Analysis of the Biological Activity of Antiserum after Immunizing with Expressed Different Domains ofStaphylococusaureusAdhesin FnBPA Isolated from Bovine Milk

SHAO Jun-gao，ZHANG Bao-jiang，LI Shan-chun，WANG Cai-die，WANG Guo-qin，SU Yan*

(VeterinaryMedicineCollegeofXinjiangAgriculturalUniversity，Urumqi830052，China)

The aim of this study was to express FnBPA-A(A domain of fibrinogen-binding region A)and FnBPA-BCD (BCD domain of fibrinogen-binding region A different domains of FnBPA) ofStaphylococcusaureus，and compare the adhesion inhibition activities of their antiserum for prevention of bovine mastitis caused byS.aureus.FnBPA-A and FnBPA-BCD encoding genes were cloned and inserted into pET-28a vector.Then the recombinant proteins were expressed and purified to immune Newzeland rabbits and mice.The adhesin binding ability，adhesion inhibition activity of their serum antibody and challenge protection ability were tested.The results showed that the antibody level，the binding ability to Fg and Fn and adhesion inhibition activity of FnBPA-A and FnBPA-BCD co-immunization group were better than that of single immunization groups.The mice antibody level of FnBPA-A immunization group and co-immunization group were better than that of FnBPA-BCD immunization group.In addition，FnBPA-A and co-immunization group showed better adhesion inhibition activity to Fg，FnBPA-BCD and co-immunization group showed better adhesion inhibition activity to Fn.The immunological protection result showed that each group had good protective effect and FnBPA-A immunization group was the best one.The results of this study may provide the basis for design of new vaccines of bovine mastitis caused byS.aureus.

Staphylococcusaureus；FnBPA-A；FnBPA-BCD；adhesion activity；biological activity

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.07.018

2014-10-28

新疆维吾尔自治区高新技术项目 (201311108)；国家自然科学基金(31260222；31160191)；自治区普通高校重点学科基础兽医学科资助项目

邵俊高(1989-)，男，江苏盐城人，硕士，主要从事兽医微生物及免疫研究，E-mail:shaojungao1108@163.com

*通信作者：苏 艳,女，教授，硕士生导师，主要从事微生物分子致病与免疫研究，E-mail: 2006au@163.com

S852.611

A

0366-6964(2015)07-1208-07