RHDV VLPs对口蹄疫病毒B细胞表位的展示效果

胡 波， 盛 蓉，2， 宋艳华， 范志宇， 魏后军， 薛家宾， 王 芳

(1.江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏南京 210014;2.南京农业大学动物医学院，江苏 南京 210095)

兔出血症(Rabbit hemorrhagic disease，RHD)是由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)引起的一种具有高度传染性、高发病率、高致死性的疾病，主要发生于2月龄以上成年兔［1-2］。兔出血症病毒属于杯状病毒属，无囊膜，直径为35～40 nm［3-6］。病毒衣壳由180个衣壳蛋白组成，表面有32个高5～6 nm的圆柱状壳粒，具有嵌杯样病毒典型的杯状结构形态［7］。RHDV衣壳蛋白VP60由579个氨基酸组成，是病毒衣壳组成的最基本单位。

衣壳蛋白VP60是病毒的免疫保护性抗原，与诱导机体抗感染免疫直接相关［8］，单独表达VP60蛋白能够自聚成病毒样颗粒(VLPs)。目前研究学者已采用多种异源系统对VP60进行表达，如杆状病毒-昆虫细胞系统［9-10］、酵母表达系统［11］和植物［12］等。通过这些系统表达获得的重组VP60蛋白免疫动物后能够抵抗病毒的感染，提供完全的免疫保护。目前VP60 VLPs作为表位载体和基因转移载体的相关研究结果表明，可在VP60 N、C末端区域以及306～307 aa位插入外源片段，且不破坏病毒样颗粒的形成，为其发展成为携带多表位的载体疫苗提供了依据［6，13-14］。

口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)复合多表位可诱导强烈的免疫反应［15-17］，O型FMDV至少有5个B细胞表位，其中包括VP1的141～160位(G-H环)和C端200～213位氨基酸残基线性表位，这2个表位是FMDV最重要的抗原位点［18］。本研究将FMDV VP1 2个B细胞表位串联后［GS-(200～213 aa)-GS-(141～160 aa)］插入VP60的C末端(位于VLPs的表面)、N末端(位于VLPs的内部)和306～307 aa之间，构建一系列嵌合VP60蛋白，并将嵌合病毒样颗粒免疫小鼠，检测机体诱导产生针对VP60和FMDV表位的特异性免疫应答，分析VLPs对外源表位的递呈能力，以及外源片段对VLPs的形成及其自身免疫特性的影响，为VP60 VLPs作为外源表位载体展示系统的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株、细胞和实验动物

载体pFastBacTMHTA购自Invitrogen公司，质粒pFastBac1-VP60由本实验室构建并保存［8］;E.coli DH5α感受态购买自北京全式金生物技术有限公司;E.coli DH10 Bac感受态由本实验室保存;Sf9昆虫细胞由本实验室培养。7～8周龄ICR雌性小鼠，购自扬州大学比较医学中心。

1.2 主要试剂与工具酶

DNA Marker DL2000及DL15000、限制性内切酶(EcoRⅠ、SalⅠ、XbaⅠ、HindⅢ)、T4 DNA连接酶、凝胶回收纯化试剂盒等购自大连宝生物工程有限公司，PfxDNA聚合酶、Taq高保真酶、脂质体LipofectamineTM2000和Grace’s不完全培养基购自invitrogen公司，柱式质粒DNAout试剂盒、柱式动物RNAout试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司，胎牛血清购自GIBCO公司，酶标兔抗小鼠IgG(FITC-IgG)购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司，DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，弗氏完全佐剂和不完全佐剂购自Sigma公司。其他试剂均为国产分析纯级。小鼠抗VP60单抗A3C为本实验室制备保存［19-20］。

1.3 引物设计

1.3.1 设计合成引物 根据GenBank数据库RHDV皖阜株VP60序列(FJ794180)，利用Primer 5.0软件设计引物，由Invitrogen公司合成，引物序列见表1。

1.3.2 合成FMDV B细胞表位序列 FMDV VP1 B细胞表位的双串联序列［GS-(411～1 060 aa)-GS-(200～213 aa)-GS］，简称FB，由Invitrogen公司合成。序列为:GTCGAC GGCAGCGTACCAAACCTGCGTGGTGACCTGCAGGTACTTGCTCAGAAAGTTGCTCGTACTC TGCCAGGCAGCCGTCACAAACAGGAAATCGTAGCTC CAGTAAAACAGAAGTTGGGCAGCTCTAGA(下划线部分是GS linker，斜体部分是酶切位点)。

表1 试验中所用引物序列Table 1 The sequences of primers used in the study

1.4 重组穿梭载体的构建

1.4.1 重组转移载体的构建 以VP60-F和VP60-1R为引物，质粒pFastBac1-VP60为模板，扩增目的片段，PCR产物经EcoR I和Sal I酶切后克隆至pFastBacTMHTA中，酶切鉴定后获得重组转移载体，命名为pFastBacTMHTA-1;以VP60-NF和VP60-3R为引物，以质粒pFastBac1-VP60为模板，扩增含有Xba I和Hind III酶切位点的PCR产物，并克隆至pFastBacTMHTA中，得到的重组转移载体命名为pFastBacTMHTA-2。以VP60-F和VP60-2R为引物，质粒pFastBac1-VP60为模板，扩增VP60 1～918 bp片段，经EcoR I和Sal I酶切后克隆至pFastBacTMHTA中，得到重组转移载体pFastBacTMHTA-3。此外，以VP60-2F和VP60-3R为引物，扩增获得VP60 918～1 740 bp片段，经Xba I和Hind III酶切后克隆至pFastBacTMHTA-3中，得到重组转移载体，命名为pFastBacTMHTA-4。FMDV(O/China/5/99 strain) B细胞表位［FB(GS-(141-160 aa)-GS-(200-213 aa)-GS)］由人工合成，FMDV-F/FMDV-R经退火处理后形成双链(Sal I/Xba I)，用T4 DNA Ligase将Sal I/Xba I酶切消化后的载体(pFastBacTMHTA-1、pFastBacTMHTA-2和pFastBacTMHTA-4)与退火磷酸化处理的FMDV VP1 B细胞表位双链DNA连接，形成3种重组转移载体 pFastBacTMHTA-VP60-2FB、pFastBacTMHTA-VP60-578FB 和 pFastBacTMHTAVP60-306FB。嵌合体结构示意图见图1。

1.4.2 重组穿梭载体的构建 制备E.coli DH10 Bac感受态细胞，分别转化3种重组转移载体，转化产物涂于含有3种抗生素(50 μg/ml卡那霉素、7 μg/ml庆大霉素、10 μg/ml四环素)、100 μg/ml X-gal和20 μg/ml IPTG的LB平板，37℃培养48 h后，挑选白色菌落培养后提取质粒。用M13/PUC通用上下游引物对提取的重组穿梭载体进行PCR鉴定，并进行测序，重组穿梭质粒分别命名为Bacmid-VP60-578FB、Bacmid-VP60-2FB和Bacmid-VP60-306FB。

图1 嵌合体VP60-2FB、VP60-306FB和VP60-578FB示意图Fig.1 The schematic diagram of the chimeric constructs (VP60-2FB，VP60-306FB and VP60-578FB)

1.5 VP60-VLPs的表达和鉴定

1.5.1 细胞转染 将鉴定为阳性的重组穿梭载体(Bacmid-VP60-578FB、Bacmid-VP60-2FB和 Bacmid-VP60-306FB)用脂质体LipofectaminTM2000转染至对数生长期的Sf9昆虫细胞。转染后每12 h观察1次，细胞病变明显时收集细胞及上清液，作为重组杆状病毒原液，4℃保存。将获得的重组杆状病毒分别命名为 rAcV-Bac-578FB、rAcV-Bac-306FB和 rAcV-Bac-2FB。将第1代病毒液反复冻融3次后以1%体积比接种Sf9细胞，进行传代，得到第2代重组病毒。

1.5.2 间接免疫荧光检测 3种重组病毒分别感染24孔细胞培养板上对数生长期的Sf9细胞，同时设置空白对照(正常细胞)和阴性对照(感染野生型杆状病毒)，本实验室构建的rAcV-Bac-VP60作为阳性对照。在感染Sf9细胞24 h后，加入预冷的乙醇固定液，4℃作用1 h;PBS洗涤3次，分别以1∶200稀释的RHDV单抗A3C和1∶100稀释的牛“O”型FMDV多抗血清为一抗，37℃孵育细胞1 h;随后用PBS反复洗涤3次，分别对应加入FITC标记的羊抗鼠IgG和FITC标记的羊抗牛IgG为二抗，37℃作用1 h。多次充分洗涤，防止留有非特异性荧光，在荧光显微镜下观察。

1.5.3 SDS-PAGE和Western blot分析 收集感染重组病毒的细胞培养物，冻融处理后加入上样缓冲液进行蛋白质电泳(SDS-PAGE)，电泳结束后，将凝胶转印NC膜，封闭后，分别以1∶200稀释的RHDV单抗A3C和1:100稀释的牛源“O”型FMDV多抗血清为一抗，分别对应以HRP标记的兔抗鼠IgG和HPR标记的羊抗牛IgG为二抗，最后DAB显色。

1.6 电镜观察

分别将重组病毒接种Sf9细胞，细胞明显病变后收集细胞培养物，反复冻融后离心取上清，经超滤管浓缩，6 000 r/min离心7 min，浓缩10倍后备用。将待检样品滴于载样铜网上，吸附作用2 min;将2%的磷钨酸染液滴于铜网上，固定2 min;最后除去多余的磷钨酸染液，室温干燥5 min，于H-7650型透射电镜上进行观察。

1.7 嵌合蛋白免疫特性研究

1.7.1 抗原的制备 3种重组杆状病毒分别接种对数生长期的Sf9细胞，出现明显病变后，用灭菌PBS(pH 7.4)重悬细胞。反复冻融3次，离心去除细胞碎片，取上清经超滤管纯化浓缩，用无菌PBS将嵌合蛋白稀释为400 μg/ml。按抗原、弗氏佐剂1∶1体积比混合，乳化后备用。1.7.2 动物免疫 7-8周龄雌性ICR小鼠共36只，随机分成6组，分别经腹腔注射乳化后的嵌合蛋白VP60-2FB、VP60-306FB、VP60-578FB、VP60、FMDV灭活疫苗和PBS，每只200 μl(40 μg)。共免疫3次，每次免疫间隔2周，首次免疫采用弗氏完全佐剂，加强免疫采用弗氏不完全佐剂。其中PBS组为阴性对照，VP60组为检测VP60特异性抗体的阳性对照，FMDV组为检测外源B细胞表位应答的阳性对照。于首免后第0、1、2、3、4、5和6周对小鼠进行断尾采血，分离血清，采用本实验室建立的检测VP60特异性抗体水平的间接ELISA方法［21］，检测各组免疫小鼠诱导产生VP60特异性抗体的水平;利用O型FMDV ELISA检测试剂盒(购自武汉科前生物制品有限责任公司)检测FMDV VP1 B细胞表位特异性抗体水平。

2 结果

2.1 目的基因的获得及其鉴定

根据GenBank数据库RHDV皖阜株VP60序列(FJ794180)，设计引物，以pFastBac1-VP60为模板，进行PCR扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，获得符合目的片段大小的条带(图2)。

图2 重组VP60基因PCR扩增结果Fig.2 PCR amplification of recombinant VP60 gene

2.2 重组转移载体的鉴定

将酶切处理的目的基因与pFastBacTMHTA进行连接，转化DH5α感受态细胞，提取重组质粒。分别利用限制性内切酶对3种重组阳性质粒进行酶切鉴定，经琼脂糖凝胶电泳可见2条大小分别为4 775 bp和1 800 bp左右的条带(图3)，证明目的片段已成功克隆至载体pFastBacTMHTA中。

2.3 重组穿梭载体的鉴定

利用pUC/M13上、下游引物对重组Bacmid质粒进行PCR扩增，产物大小约为4 000 bp，而以同样引物对空Bacmid质粒进行扩增，产物大小约为300 bp;以目的基因上、下游引物对重组Bacmid质粒进行PCR扩增，获得大小为1 800 bp左右的条带，证明转座成功。

图3 重组质粒的酶切鉴定Fig.3 Identification of the recombinant plasmid by restriction endonuclease digestion

2.4 嵌合蛋白的表达和鉴定

将重 组 病 毒 rAcV-Bac-578FB、rAcV-Bac-306FB、rAcV-Bac-2FB和rAcV-Bac-VP60分别感染Sf9细胞，其中rAcV-Bac-VP60为阳性对照。感染24 h后，以RHDV单抗A3C为一抗，FITC标记兔抗鼠IgG为二抗，进行荧光染色。结果(图4)表明，感染重组杆状病毒的Sf9细胞具有很强的特异性荧光，而感染野生型杆状病毒的Sf9细胞和空白对照细胞无荧光，说明嵌合蛋白得到有效表达。

图4 间接免疫荧光试验(IFA)检测3种嵌合VP60蛋白的表达Fig.4 Indirect immunofluorescence assay(IFA)analysis of the expression of chimeric VP60 proteins

将重组病毒 rAcV-Bac-578FB、rAcV-Bac-306FB、rAcV-Bac-2FB和rAcV-Bac-VP60分别感染Sf9细胞，其中rAcV-Bac-VP60为阳性对照。感染24 h后，以牛FMDV多抗血清为一抗，FITC标记羊抗牛IgG为二抗，进行荧光染色。结果(图5)表明，分别感染 rAcV-Bac-578FB、rAcV-Bac-306FB和rAcV-Bac-2FB的Sf9细胞具有很强的特异性荧光，而感染AcV-Bac-VP60、野生型杆状病毒的Sf9细胞和空白对照细胞无荧光，说明嵌合蛋白携带的VP1 B细胞表位获得有效的表达。

SDS-PAGE和Western blot结果(图6)显示:以VP60单抗A3C为一抗的NC膜在约6.0×104处出现目的条带，与预期大小一致，说明嵌合蛋白得到有效表达;以FMDV牛多抗血清为一抗的NC膜同样在6.0×104处出现目的条带，与预期大小一致，说明FMDV B细胞表位得到有效表达，且免疫印迹与电泳的目的条带位置相符。

图5 IFA检测3种嵌合蛋白中B细胞表位的表达Fig.5 IFA analysis of the expression of B cell epitope in chimeric proteins

图6 3种嵌合蛋白的SDS-PAGE和Western blot分析Fig.6 SDS-PAGE and Western blot analysis of the chimeric proteins

2.5 电镜观察结果

电镜观察结果(图7)显示，本试验构建并表达的3种嵌合蛋白均可形成大小约为40 nm的VLPs，形态和大小均与天然RHDV VLPs的粒子(阳性对照)相似，说明外源表位的插入未影响VP60自身VLPs的组装。

2.6 嵌合蛋白诱导小鼠的体液免疫应答

为检测嵌合蛋白VP60刺激免疫系统产生的体液免疫反应，本研究用间接ELISA检测方法测定小鼠血清中抗载体VP60的特异性抗体水平和抗外源FMDV B细胞表位的特异性抗体水平。实验小鼠分为VP60-2FB组、VP60-306FB组和VP60-578FB组，同时设立VP60组和FMDV灭活疫苗组作为阳性对照，PBS组作为阴性对照。分别于首免后0、1、2、3、4、5、6周对各组小鼠进行尾静脉采血，分离血清进行检测。结果显示:首免后4-6周，3种嵌合蛋白均可产生较强的VP60特异性抗体，与PBS组比较差异显著(P＜0.05)(图8);3种嵌合蛋白刺激机体产生的表位特异性IgG抗体与VP60组相比差异显著(P＜0.05)，VP60组未产生表位特异性抗体应答，3种嵌合蛋白均可诱导产生较强的表位特异性抗体应答水平(图9)。此外，与嵌合VP60组相比，作为阳性对照的FMDV商品化灭活苗组诱导产生的表位特异性IgG抗体水平显著高于嵌合VP60组(P＜0.05)(图9)。

图7 RHDV VP60蛋白和3种嵌合蛋白病毒样粒子的电镜观察结果Fig.7 RHDV VP60 protein and chimeric VP60 VLPs under electron microscopy

图8 间接ELISA检测小鼠血清中VP60特异性抗体水平Fig.8 The detection of anti-VP60 antibody level in the serum of mice by indirect ELISA

3 讨论

杯状病毒成球形或近球形，无囊膜，核衣壳呈二十面体对称，由180个单一结构蛋白组成，病毒核酸为单股、正链线性RNA(ssRNA)［22-26］。杯状病毒的VLPs结构简单，由单一衣壳蛋白自行装配而成，是一种研究VLPs的理想模型。很多病毒的宿主范围很广，不仅可以感染人类，而且可以感染多种动物，这就为VLPs作为疫苗和药物的应用带来了机遇。开发一种多功能的VLPs展示平台，从而可以避免体内预先的中和抗体反应对VLPs所介导的免疫应答的限制，具有重要的意义。RHDV宿主专一性较强，只对兔易感，对人和其他动物不存在安全威胁; RHDV作为杯状病毒的成员之一，其VP60可自行装配形成VLPs，使RHDV VP60作为研究其他动物疾病甚至是人类疾病VLPs疫苗的研究模型成为可能，但其作为展示系统的可行性、效果及其适用范围还需要进一步研究。

图9 间接ELISA检测FMDV B细胞表位抗体水平Fig.9 The detection of anti-FMDV B cell epitope antibody level in the serum of mice by indirect ELISA

本研究通过插入外源表位(FMDV VP1 B细胞表位)构建VP60嵌合蛋白，研究VP60作为载体递呈外源表位的能力，分析外源表位的插入是否影响其自身病毒样颗粒的形成，评价VP60作为外源表位展示系统的可行性。研究结果表明，3种嵌合蛋白均能够有效表达并形成VLPs，说明在VP60蛋白的第306～307 aa、C端和N端插入42 aa外源片段均不影响VLPs的组装，具备自我装配能力是VLPs疫苗候选物的基本特性。

选择口蹄疫病毒两个重要的B细胞表位GS-(200～213 aa)-GS-(141-160 aa)作为外源插入表位，构建VP60嵌合VLPs。通过IFA和Western blot试验发现VP60嵌合VLPs获得有效表达，并具有VP60特异性和FMDV表位特异性抗原反应。动物试验结果显示，3种嵌合蛋白免疫的小鼠均能够诱导产生强烈的VP60特异性和表位特异性体液免疫应答。综上所述，VP60 VLPs能够有效递呈外源表位，刺激机体对外源B细胞表位产生体液免疫应答，可作为异源抗原的展示载体。此外，我们在前期研究的基础上，将单串联的B细胞表位增加成双串联的B细胞表位，外源片段大小增加至126 bp，序列的增加不影响VLPs的形成和免疫原性，可见VP60-VLPs作为递呈外源抗原的展示载体的容耐性较大，可容纳至少42 aa的外源片段。

本研究以VP60-VLPs为基础，通过在VP60 N端、C端和306～307 aa位插入双串联FMDV B细胞表位序列构建嵌合VLPs，研究结果表明VP60的N端、C端和306～307 aa位置均适合外源氨基酸片段插入，嵌合VLPs均能够进行自我组装，且能够有效展示长度为42 aa的外源片段。此外，VP60作为载体所能容纳的最长外源氨基酸片段长度仍需进一步研究。

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