加味五子衍宗方及其活性部位对脂多糖诱导神经炎症反应的抑制作用及机制研究

宋芳娇 曾克武 屠鹏飞 王学美

“肾主智，肾虚则智不足”是中医学的传统理论，研究室根据多年临床经验和“补肾以益智”的中医理论在古方五子衍宗丸基础上加淫羊藿形成加味五子衍宗方，其成分包括枸杞子、菟丝子、五味子、车前子、覆盆子和淫羊藿。据前期临床疗效和实验观察，加味五子衍宗方可有效改善轻度认知障碍患者的记忆功能，对海马体积的萎缩有一定的防治作用［1］。此外，加味五子衍宗方及其总黄酮、总多糖能提高东莨菪碱所引起的记忆获得障碍模型小鼠的胆碱能系统活性，提高学习记忆水平［2］。轻度认知障碍是阿尔茨海默病(alzheimer disease，AD)的早期临床表现。近年来，随着对AD研究的深入，许多学者认为AD是一种中枢神经系统慢性炎症性疾病，脑内炎症不仅能引起神经炎性损伤和神经元的退行性病变，还可能是其他病理特征(老年斑和神经元纤维缠结)形成和发展的诱因。本研究从抗炎角度出发，以脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导BV-2小胶质细胞系炎症模型为研究对象，探讨加味五子衍宗方及其活性部位对神经系统的保护作用和潜在机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 BV-2小胶质细胞系购自中国医学科学院细胞中心。

1.1.2 药物 枸杞子、菟丝子、覆盆子、五味子、车前子和淫羊藿均购自北京同仁堂。

1.1.3 试剂与仪器 胎牛血清(美国Gibco公司)、DMEM培养基(美国Hyclone公司)、NO化学法试剂盒(中国南京建成生物公司)、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、氯化硝基四氮唑蓝(nitrotetrazolium blue chloride，NBT)、溴化噻唑蓝四氮唑(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT)、二氢乙锭(dihydroethidium，DHE)荧光染料、4'，6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐(4'，6-Diamidino-2-phenylindole，DAPI)(美国Sigma公司)、兔抗大鼠iNOS，COX-2和β-actin多克隆抗体(美国CST公司)、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的羊抗兔 IgG(美国Vector公司)、电化学发光(electrochemical luminescence ECL)试剂盒(美国Pierce公司)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)(中国北京鼎国昌盛生物技术有限公司)、荧光显微镜(日本奥林巴斯公司)、2200 PRO凝胶成像分体系统(美国伊斯曼柯达公司)、Sunrise-Basic酶标仪(瑞士帝肯公司)，UV-2401PC紫外分光光度仪(日本岛津公司)。

1.2 加味五子衍宗方及其活性部位的提取和测定

(1)枸杞子、菟丝子、覆盆子、五味子、车前子、淫羊藿按质量比 8∶8∶4∶1∶2∶8混合，为提高药物提取率，溶剂采用70%乙醇，用10倍和5倍量微沸提取2遍，每遍1小时。(2)大孔树脂柱分离:将复方提取液过大孔树脂柱，分别用4倍柱体积纯净水、20%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和2倍柱体积95%乙醇洗脱，收集各洗脱液。(3)将各部分洗脱液60℃低温减压浓缩，冷冻干燥成粉末，4℃避光保存，使用时用培养液或DMSO溶解(终浓度为5‰)，用0.2μm滤膜除菌后作用于细胞。(4)分离组分成分鉴定:总多糖含量检测用酚硫法，葡萄糖为标准品，紫外分光光度仪490 nm处测定;总黄酮含量检测用氢氧化钾显色法，芦丁为标准品，紫外分光光度仪216 nm处测定。

1.3 细胞培养和处理

BV-2小胶质细胞系37℃、5%CO2的培养箱中培养，加入高糖DMEM培养基(含10%胎牛血清，100 U/L青霉素和100μg/L链霉素)，每1天传代1次。

将细胞分为空白对照组，炎症模型组和药物治疗组。其中MTT细胞存活率检测时药物治疗组分为复方组，水提组，20%醇提组，50%醇提组，70%醇提组和95%醇提组6组，其余抗炎机制研究实验药物治疗组分为复方组，水提组，20%醇提组，50%醇提组4组。LPS诱导炎症模型的浓度为1μg/mL，药物浓度设置为200μg/mL。药物治疗和LPS同时处理细胞，方法参照本课题组前期实验［3］。

1.4 MTT细胞活性分析

BV-2小胶质细胞系以5×104/孔密度接种于48孔板，培养过夜，空白组采用上述高糖DMEM培养基换液，模型组用LPS诱导炎症，药物组LPS与药物同时处理细胞，刺激维持24小时，弃上清，加MTT染色，温箱孵育4小时，弃上清，加入500μL DMSO，酶标仪570 nm处检测光密度(optical density，OD)值。

1.5 细胞上清液NO含量测定

BV-2小胶质细胞系接种于48孔板，密度为5×104/孔，空白组换液，模型组用LPS诱导炎症，药物组加药和LPS处理，刺激维持24小时，用NO化学法试剂盒检测NO浓度，按照说明书操作:吸取300μL培养液上清，加试剂1和2(NO化学法试剂盒提供)，6000 rmp离心10分钟，取160μL上清，加入显色剂，酶标仪570 nm波长检测OD值。

1.6 Western blot蛋白分析

将细胞接种于∅100 mm培养皿中，培养过夜，空白组换液，模型组用LPS处理细胞，药物组LPS协同药物处理细胞，刺激维持24小时后收集细胞，用RIPA裂解液(内有Cocktail蛋白酶抑制剂)裂解细胞，获取总蛋白。将总蛋白用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用半干转膜仪将蛋白转移到聚偏氟乙烯膜上，5%脱脂奶粉封闭5分钟。兔抗鼠iNOS，COX-2和β-actin一抗 (1∶1000)室温孵育2小时，充分洗涤，加入HRP标记的羊抗兔二抗(1∶1000)室温孵育1小时，充分洗涤后加入ECL液，室温反应5分钟，在凝胶成像系统上拍照。

1.7 免疫荧光检测核转录因子-κB核转位情况

在24孔板中铺入显微镜盖玻片，多聚赖氨酸包被后，接种密度为10×104细胞于玻片上，药物预处理30分钟后加LPS诱导，温箱孵育1小时，4%多聚甲醛包被，封闭液(0.2%tritonX－100+5%BSA)室温孵育30分钟，加一抗(1∶200稀释)，4℃过夜，PBS充分洗涤，加二抗(1∶200稀释)，室温摇床1小时，PBS充分洗涤，DAPI(50μg/mL)37℃避光处理30分钟，PBS充分洗涤，甘油-PBS封片剂封片，用荧光显微镜拍照。

1.8 免疫荧光检测ROS的产生

将细胞接种于铺有盖玻片的24孔内，10×104/孔，多聚赖氨酸包被后，药物处理24小时后，PBS冲洗1遍，1μmol/L ROS荧光探针(DHE)温箱处理30分钟，PBS充分洗涤，DAPI处理，充分洗涤，封片，荧光显微镜拍照。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 各分离部位总多糖和总黄酮含量

本实验中总多糖以葡萄糖为对照品，苯酚－浓硫酸方法检测，总黄酮以芦丁为对照品，紫外分光光度法检测。本次实验中的总方提取物含(62.35±0.05)%总多糖成分，(0.08% ±0.03)总黄酮成分，抗炎效果最好的50%醇提组中含(46.66±0.04)%总多糖成分，(4.66±0.12)%总黄酮成分，其中各洗脱成分组中，含总黄酮量最多的为70%醇提组，含总多糖量最多的为水提组，具体见表1。

2.2 各分离组分对BV-2小胶质细胞系存活率的影响

加味子五子衍宗方水提组、20%醇提组和50%醇提组对细胞存活率没有明显影响，70%醇提组和95%醇提组对细胞毒性较大，经LSD检验，与空白组相比P＜0．01。因此在后续实验中主要针对总提取物、水提组、20%醇提组和50%醇提组的抗炎机制进行了研究，具体见表2。

表1 加味子五子衍宗方各分离部位总多糖、总黄酮含量±s，%，n=3)

表1 加味子五子衍宗方各分离部位总多糖、总黄酮含量±s，%，n=3)

醇提组总多糖含量 62.35±0.05 99.24±0.05 47.68±0.01 46.66±0.0复方组 水提组 20%醇提组 50%醇提组 70%醇提组 95%4 28.91±0.09 9.97±0.03总黄酮含量 0.08±0.03 － 3.53±0.05 4.66±0.12 5.22±0.08 3.13±0.04

表2 加味子五子衍宗方各活性部位对BV-2小胶质细胞系存活率的影响±s，%，n=3)

表2 加味子五子衍宗方各活性部位对BV-2小胶质细胞系存活率的影响±s，%，n=3)

醇提组100.01±0.51 90.40±13.92 82.22±6.01 92.09±0.37 95.75±0.29 95.24±1.95 25.24±3.75a 7.38±1.35空白对照组 模型组 复方组 水提组 20%醇提组 50%醇提组 70%醇提组 95%a

表3 MWP各活性部位对细胞上清液中NO含量的影响(±s，n=3)

表3 MWP各活性部位对细胞上清液中NO含量的影响(±s，n=3)

注:模型组与空白组相比，a P＜0.01;各药物治疗组与模型组相比，b P＜0.05，c P＜0.01。

空白对照组 模型组 复方组 水提组 20%醇提组 50%醇提组9.14±1.03 16.51±1.10a 11.88±1.73b 12.89±0.50c 13.95±0.85b 9.62±1.27c

2.3 加味五子衍宗方及其各活性部位对细胞上清液中NO的影响

NO与炎症反应关系密切，炎症反应中大量产生的NO具有细胞毒性，是炎症反应造成正常组织损伤的原因之一。加味五子衍宗方及其各活性部位均能降低NO产生，经LSD检验复方组和50%醇提组与空白对照组相比有统计学差异(P＜0．01)，且50%醇提组要优于其他组分和复方组，可能是神经炎性保护的主要物质基础，见表3。

2.4 加味五子衍宗方复方及其各活性部位对炎症相关蛋白表达的影响

一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)是核转录因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)调控的2个重要的炎症相关蛋白，在炎症反应中具有非常重要的作用。NO和PGE2等炎性因子分别是iNOS和COX-2合成的产物，用Western blot检测此两种蛋白表达，可以帮助阐明细胞炎症激活和药物的抗炎机制。MWP复方及其各活性部位可降低iNOS和COX-2的表达，其中50%醇提组的抑制作用最明显且优于复方组，见图1。

图1 MWP及其活性部位对LPS激活的BV-2小胶质细胞系中iNOS和COX-2蛋白表达的影响

2.5 加味五子衍宗方及其活性部位对激活BV-2小胶质细胞系NF-κB核转移的影响

NF-κB一种多效性的转录因子，当细胞处于非激活状态，NF-κB存在于细胞浆，外界信号(氧化应激、LPS或细胞因子)刺激细胞后，NF-κB从细胞浆转移到细胞核，促进相应基因转录表达，参与炎症因子的生成。如图2所示:NF-κB被绿色荧光标记，DAPI染色细胞核为蓝色，空白组细胞核内几乎没有绿色荧光标记，荧光标记在核外周的细胞浆，模型组细胞内NF-κB绿色荧光与蓝色荧光有重叠现象，说明NF-κB从细胞浆转移至细胞核，加味五子衍宗方及其活性部位组细胞核内绿色荧光减少，说明核转位现象被抑制，具体见图2。

2.6 加味五子衍宗方及其活性部位对激活BV-2小胶质细胞系ROS含量的影响

活性氧(reactive oxygen species，ROS)参与细胞多种生理和病理形成机制，高浓度的ROS能通过氧化应激反应诱导细胞凋亡甚至坏死。DHE是ROS的荧光探针，可透过细胞膜被ROS氧化产生红色荧光，根据细胞中红色荧光的产生可判断ROS的含量。DAPI染色细胞核为蓝色，如图3所示:模型组DHE红色荧光产生明显，说明LPS可激发BV-2产生大量ROS，空白组和药物组细胞红色荧光产生均不明显，其中50%醇提组红色荧光略高于其他组，说明MWP及其活性部位能有效抑制激活细胞ROS的产生，50%醇提组抗氧化能力较其他组弱，具体见图3。

3 讨论

随着全世界人口老龄化速度的加快，老年期痴呆已成为全球性公共健康问题。AD在老年期痴呆中发病率最高，对AD的研究已成为热点。加味五子衍宗方经过多年的临床观察和实验研究发现其有良好的临床抗痴呆和神经保护作用。AD的病因复杂，涉及诸多病理生理过程［4］，单一靶点药物往往不能有效抑制病程发展，并且存在毒副作用［5］，中药毒副作用小且在防治痴呆方面有悠久的历史［6-7］，特别是针对像AD这种的多因素相关的复杂性疾病，更能显示出其多靶点，多途径的治疗优势。

图2 加味五子衍宗方及其活性部位对LPS激活的BV-2细胞NF-κB核转移的影响

近年来，炎症反应和氧化应激在AD的发生发展中的作用越来越受到关注［8］。小胶质细胞(microglia，MG)是神经系统中的专职巨噬细胞，在AD神经病理变化中起“双刃剑”作用。一方面，激活的MG可吞噬β淀粉样蛋白，减轻β淀粉样蛋白聚集对神经元的损伤，另一方面，激活的MG可释放大量的炎症因子(如NO和TNF-α)，这些炎症因子，既可诱发脑内炎症，造成神经元的炎性损伤，又能继续诱发炎症，产生炎症瀑布效应，形成恶性循环［9］。MG在炎症反应中活化并释放炎症因子的这一过程，可为新药的研发提供靶点和实验依据。本实验用LPS诱导BV-2小胶质细胞系形成炎症模型，通过对NF-κB信号通路中的蛋白表达和炎症因子的释放探讨加味五子衍宗方及其活性部位对神经系统保护作用的机制。加味五子衍宗方及其活性部位可降低NO的释放，抑制COX-2和iNOS蛋白的表达，抑制NF-κB核转移和ROS的释放，从抗炎和抗氧化方面对神经细胞产生保护作用，且50%醇提组的抗炎效果优于其他活性部位和复方，为加味五子衍宗方神经保护研究奠定了基础。

［1］ 富宏，王学美，刘庚信，等．加味五子衍宗颗粒对轻度认知障碍患者记忆功能及海马体积的磁共振研究［J］．中国中西医结合杂志，2006，26(12):1066-1069．

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［9］ 陈艳，王光楠，金英．小胶质细胞及其炎性细胞因子参与阿尔茨海默病因果关系的研究［J］．中国医药导报，2008，5(27):16-18．