决明子提取物对非酒精性脂肪肝大鼠的护肝、拮抗胰岛素抵抗和抗氧化糖基化作用

李博萍 陈依雨 潘竞锵 赵汝霞 郑琳颖 吕俊华

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的发病机制可能与脂肪变性和氧化应激及脂质过氧化反应有关［1］。决明子(Cassiae Semen)为豆科植物决明Cassia obtusifolia L．或小决明Casia tora L．的干燥成熟种子，性味甘、苦、咸、微寒，归肝、大肠经，具有清肝明目，利水通便的作用。有研究证明，决明子提取物具有较好的抗氧化作用［2］。已知决明子含有多种植化成分，作者以往研究表明，决明子提取物能够改善脂肪肝所引起的脂质过氧化损伤，增强眼晶状体抗氧化能力以及调节血糖和糖基化产物代谢［3-4］。本研究采用高脂与果糖饮食建立脂肪肝动物模型，探讨决明子提取物对该模型大鼠防治脂肪肝作用的抗氧化机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级SD大鼠72只，6周龄，雌雄各半，体质量150～180 g，标准饲料喂养，购于广东省医学实验动物中心。生产许可证号:SCXK(粤)2008-0002。

1.1.2 试剂和药品 决明子提取物(陕西浩洋生物科技有限公司);盐酸二甲双胍片(深圳市中联制药有限公司);高脂饲料(69.9%普通饲料+20%猪油+10%蔗糖+0.1%他巴唑)和普通饲料(广东省医学实验动物中心提供);果糖(Archer Daniels Midland Company);戊巴比妥钠(国药集团化学试剂有限公司);糖化血红蛋白试剂盒、考马斯亮兰试剂盒、总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)检测试剂盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)试剂盒、一氧化氮测试盒和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)测定试剂盒，均为南京建成生物工程研究所产品;葡萄糖测定试剂盒(上海荣盛生物药业有限公司);胰岛素放免试剂盒(北京华英生物技术研究所提供);大鼠果糖胺(fructosamine，FMN)和大鼠晚期糖基化终产物(advanced glycation end products，AGES)酶联免疫吸附法检测试剂盒，均为美国Assay公司产品;蒸馏水(distilled water，DW)。

1.1.3 仪器设备 FHS-2A可调高速组织匀浆机(金坛市宏华仪器厂);DK-S22型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司);TGL-16C型高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂);r-911全自动放免计数仪(中国科技大学实业总公司);多功能全波长酶标仪(BioTelc USA，Synergy HT);Olympus光学显微镜，石蜡包埋机(湖北欧美莱医疗科技有限责任公司);Slfe手动旋转式石蜡切片机。

1.2 方法

1.2.1 模型建立 参照文献方法［4-7］造模6周，成功复制大鼠NAFLD模型，并分为正常对照组与模型组。模型组按体质量、性别随机分为:模型对照组(DW 10 mL/kg)、二甲双胍组(0.2 g/kg)、决明子(SCE)高、中、低剂量组(2 g/kg、1 g/kg、0.5 g/kg)灌胃给药;正常对照组与模型对照组均灌胃给予蒸馏水(DW 10 mL/kg)，持续4周。

1.2.2 标本采集及指标测定 参照文献方法，在第10周末，给所有大鼠采血。离心取血清，按照试剂盒方法要求测定大鼠血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、GSP-Px、NOS 活性，血清一氧化氮(nitric monoxide，NO)、MDA、FMN、AGEs、葡萄糖含量(fasting blood glucose，FBG)，血清胰岛素水平(insulin，INS)，并计算胰岛素敏感度(insulin sensitivity in-dex，ISI)，以及AGEs的含量。取大鼠肝脏，迅速称湿重，用预冷的生理盐水冲洗，按重量1∶9加生理盐水，匀浆器研磨制成10%组织匀浆，用于测定肝脏SOD、NOS 活性，肝脏 N O、MDA 含量［4，8］。解剖大鼠，取肝脏用10%乙醛固定后，切片，HE染色，光镜下(×200倍)观察肝细胞病理改变［8］。

1.3 统计学处理

采用SPSS 16.0统计软件进行实验数据分析，数据用均数±标准差±s)表示。采用单因素方差分析，组间差异采用SNK检验比较，P＜0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 决明子乙醇提取物(semen cassiae extract，SCE)对脂肪肝大鼠血清 A GEs、FMN、FBG、INS以及ISI的影响

与正常组大鼠比较，模型大鼠血清AGEs、FMN、FBG、INS水平明显升高(P＜0.01)，ISI加重，提示出现胰岛素抵抗和血糖代谢紊乱;二甲双胍和SCE处理后，降低模型大鼠血清 A GEs、FMN、FBG、INS含量，并明显改善 I SI(P＜0.01，P＜0.05)，但低剂量组对INS的降低作用不明显。高剂量组对AGEs和FMN的影响较中剂量组有显著差异(P＜0.05，P＜0.01)，对AGEs和ISI的影响较低剂量组有显著差异(P＜0.05，P＜0.01)。其他指标，低、中、高剂量组之间可见一定的量效关系，但无统计学意义(P ＞0.05)，见表1。

2.2 SCE对脂肪肝大鼠血清抗氧化能力的影响

与正常组大鼠比较，模型大鼠血清 SOD、GSH-Px的活性明显降低(P ＜0.01)，MDA、NOS、NO的含量明显增加(P＜0.01)。二甲双胍和SCE处理后，可提高模型大鼠血清 SOD、GSH-PX的活性(P＜0.01)，降 低 血 清 MDA、NOS、NO 含 量(P＜0.01)，但低剂量组作用较弱。高剂量组上述几个指标较低剂量组有显著差异(P＜0.01)，对SOD、NO和NOS的影响较中剂量组有显著差异(P＜0.01)。中剂量组对GSH-PX、MDA和NO的影响较低剂量组有显著差异(P＜0.01)，见表2。

2.3 决明子提取物对脂肪肝大鼠肝脏抗氧化能力的影响

与正常组大鼠比较，模型大鼠肝组织SOD的活性明显降低(P＜0.01)，MDA、NOS、NO 的含量明显增加(P＜0.01)。二甲双胍和SCE处理后，明显提高模型大鼠肝脏组织SOD活性(P＜0.01)，降低MDA、NOS、NO 含量(P ＜0.01，P ＜0.05)，而中、低剂量组的作用较弱。高剂量组对SOD和NO的影响较中剂量组有显著差异(P＜0.05)，对NO和NOS的影响较低剂量组有显著差异(P＜0.01)。其他指标，低、中、高剂量组之间可见一定的量效关系，但无统计学意义(P＞0.05)，见表3。

表1 决明子提取物对脂肪肝大鼠血清血清糖基化产物、FBG、INS以及ISI的影响( ± s ，n=12)

表1 决明子提取物对脂肪肝大鼠血清血清糖基化产物、FBG、INS以及ISI的影响( ± s ，n=12)

注:与正常组比较，a P ＜0.01;与模型组比较，b P ＜0.05，c P＜0.01;与 SCE 高剂量组比较，d P ＜0.05，e P＜0.01。

1.70±0.09模型组 60.50±10.42a 161.4±13.2a 11.30±2.19a 19.32±2.62a －2.24±0.05a二甲双胍组 36.76±7.24c 96.1±32.7c 5.10±2.00c 12.89±2.86c －1.76±0.07c SCE高剂量组 27.86±1.60c 94.1±17.7c 4.50±1.05c 11.12±4.6c －1.65±0.24c SCE中剂量组 33.31±6.50ce 111.5±15.2cd 4.9±0.53c 14.16±6.59b －1.81±0.25c SCE低剂量组 34.19±4.8e 118.0±35.9c 5.31±0.88c 17.08±7.60 －1.90±0.22 ISI正常组 42.02±4.30 95.2±20.8 5.89±1.49 11.14±2.10 －组别 FMN/(nmol·mL－1) AGEs/(ng·L－1) FBG/(mmol·dL－1) INS/(uIU·mL－1)cd

表2 决明子提取物对血清SOD、MDA、GSP-Px、NO、NOS含量的影响± s ，n=12)

表2 决明子提取物对血清SOD、MDA、GSP-Px、NO、NOS含量的影响± s ，n=12)

注:与正常组比较，a P＜0.01;与模型组比较，b P＜0.05，c P＜0.01;与SCE高剂量组比，d P＜0.05，e P＜0.01;与SCE中剂量组比较，f P＜0.01

组别 SOD/(U·mL－1) GSH-Px/(umol·L－1) MDA/(U·mL－1) NO/(umol·L－1) NOS/(IU·L－1).94±0.33模型组 52.61±6.97a 488.0±15.3a 13.82±3.98a 7.92±3.00a 5.87±1.40a二甲双胍组 76.84±8.81c 545.4±8.8c 9.23±3.11c 3.23±0.99c 3.72±0.80c SCE高剂量组 68.28±7.06c 536.9±24.1c 8.75±2.74c 2.25±1.18c 3.91±0.23c SCE中剂量组 53.44±16.56e 533.1±37.5c 10.17±1.92c 6.97±4.80ce 4.53±0.54ce SCE低剂量组 44.33±6.77e 497.2±10.5ef 12.58±1.62ef 13.98±4.11ef 4.76±0.41正常组 87.32±5.39 516.0±20.4 9.31±1.53 3.43±2.08 3 be

表3 决明子提取物对肝脏SOD、MDA、NO、NOS含量影响± s ，n=12)

表3 决明子提取物对肝脏SOD、MDA、NO、NOS含量影响± s ，n=12)

注:与正常组比较，a P ＜0.01;与模型组比较，b P ＜0.05，c P＜0.01;与 SCE 高剂量组比，d P ＜0.05，e P ＜0.01

组别 SOD/(U·mgprot－1) MDA/(nmol·mgprot－1) NO/(umol·gprot－1) NOS/(U·mgprot－1)539.0±59.0 4.66±1.15 1.72±0.64 0.40±0.05模型组 385.9±93.2a 7.75±3.82a 4.17±1.75a 0.68±0.14a二甲双胍组 463.0±71.1c 4.88±1.77b 2.45±0.62c 0.55±0.08c SCE高剂量组 527.3±81.2b 4.82±1.58b 1.95±0.36c 0.53±0.14b SCE中剂量组 455.8±85.9d 5.34±1.78b 2.53±0.79cd 0.65±0.15 SCE低剂量组 453.4±107.0 5.94±1.51 2.94±1.16e 0.68±0.09正常组e

2.4 决明子提取物对脂肪肝大鼠肝脏组织病理学作用

正常组大鼠肝细胞结构正常，肝索排列整齐，肝窦完整清晰，无明显的病理变化;模型组大鼠肝细胞明显肿胀呈圆形，细胞核被挤向一边，大量肝细胞出现颗粒、空泡变性，局部肝细胞出现坏死，胞浆内充满大小不等的脂滴，肝窦不清，肝索排列紊乱。决明子处理4周后，模型大鼠肝细胞脂滴浸润明显减少，肝窦清晰，肝索排列较整齐，见图1。

图1 决明子提取物对脂肪肝大鼠肝脏病理变化的影响(×200倍)

3 讨论

脂肪肝是肝脏对各种代谢异常改变所引起的肝实质细胞脂肪样病变［1］。根据病因，脂肪肝主要分为两大类:酒精性脂肪肝与非酒精性脂肪肝［1，8］。其中，非酒精性脂肪肝的发病机理较为复杂，可由单一的病因引起，也可以是多种病因同时作用或先后参与病程。目前普遍接受的是“二次打击”学说，即将非酒精性脂肪性肝病的发生机制主要归结为两个打击［1，8］。初次打击过程中，由于各种原因的代谢性疾病以及IR导致外周脂解增多，肝脏合成脂肪增多，从而FFA增多、TG增多，过多的FFA和TG堆积在肝脏组织内，使得肝脏组织发生脂质沉积损伤，诱发脂肪肝;由于脂肪肝的持续发展，肝脏中的ROS持续增多，导致了二次打击的发生，脂质过氧化损伤使得肝细胞释放脂质过氧化物，它们与肝细胞释放的细胞因子进一步介导肝细胞死亡和肝纤维化形成、肝内炎症细胞浸润等改变，最终可能发生不可逆的肝硬化［1，8］。

本研究中的脂肪肝模型大鼠，经过决明子不同剂量组的给药治疗后，与NAFLD模型对照组比较，各给药组大鼠血清FBG、INS含量降低，ISI指标得到改善，说明决明子改善了模型大鼠的IR以及调节了其血糖代谢紊乱的症状，对脂肪肝的发生发展起到了控制的作用。

大量研究证明，二甲双胍能拮抗胰岛素抵抗，减少肝脏脂肪积蓄，并抑制炎症损伤和氧化-糖基化反应，从而改善脂肪肝及其并发症［9-10］，因此作为本组实验的阳性对照药。本组实验结果显示，经过二甲双胍或决明子给药治疗后的脂肪肝大鼠血清SOD、GSH-Px活性有不同程度的增高，血清和肝脏组织中MDA、NOS、NO含量显著降低，血糖、果糖胺和AGEs含量也显著降低，药效作用强度有一定的剂量依赖性关系，说明决明子可能通过抑制脂质过氧化损伤，防止“二次打击”的形成。糖基化终产物及其受体可激活氧化应激及炎症反应产生级联反应［11］，二甲双胍或决明子可能对氧化应激-糖基化反应起到阻遏作用，遏制糖基化反应对氧化应激及炎症反应激活所产生的级联反应。

综上所述，决明子提取物中的有效成分的护肝作用，可能通过拮抗胰岛素抵抗、改善糖代谢紊乱、提高抗氧化能力、抑制脂质过氧化损伤和氧化应激-糖基化反应，从而达到保肝的作用。

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