牡丹皮对内毒素性急性肺损伤大鼠的保护作用

2015-03-26 08:31汤明杰叶永山张旗苏浬赵跃东曹春琪雷海民李强
环球中医药 2015年10期
关键词:牡丹皮肺泡炎症

汤明杰 叶永山 张旗 苏浬 赵跃东 曹春琪 雷海民 李强

急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是各种直接或间接致伤因素导致的肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤,出现弥漫性肺泡毛细血管膜损伤所致肺水肿和肺不张、微血栓形成、微循环障碍等病理特征[1-2]。ALI发病急、进展快、病死率极高,是临床上的急危重症,目前尚无疗效较好的药物治疗。目前研究表明肺内过度的炎症反应是ALI发病的重要机制。牡丹皮具有清热凉血、活血化瘀功效,现代药理研究表明牡丹皮具有镇痛抗炎、改善血流动力学和微循环系统等作用[3],且对肺损伤有一定的保护作用[4]。因此本文从炎性细胞、促炎因子及蛋白的释放来探讨牡丹皮对ALI的干预作用,并期为临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 实验动物清洁级wistar雄性大鼠60只,体质量200~220g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,动物合格证号:11400700019196。

1.1.2 试剂及主要仪器 牡丹皮(安国药材市场,批号:20130918),经北京中医药大学刘春生教授鉴定为毛茛科芍药属植物牡丹的干燥根皮;大肠杆菌内毒素(L2880,sigma);牛血清白蛋白(A7030,PH-7,sigma);醋酸地塞米松片(H12020363,天津柏海药业);TNF-α、IL-6试剂盒(上海蓝基生物科技有限公司);吉姆萨染液(北京博奥拓达科技有限公司);考马斯亮蓝G-250(北京拜尔迪生物科技有限公司)。TXD3型离心甩片机(湖南湘仪实验室一起开发有限公司);MK3型酶标仪(赛默飞仪器有限公司);Effendorf 5810R离心机(德国);BX40F4型光学显微镜(OLYMPUS,日本);AxioCam ERC5s成像系统(德国蔡司数码成像系统)。

1.2 实验方法

1.2.1 牡丹皮水提物制备 牡丹皮药材,10倍量水回流提取两次,每次2小时,过滤,滤液合并,减压浓缩即得牡丹皮水提物﹙1 mL≈0.35 g﹚。

1.2.2 ALI模型制备 将大鼠随机均分为5组:生理盐水对照组、模型组、阳性药(地塞米松)组、治疗组及预防组。各组分别用水合氯醛腹腔注射麻醉,除对照组以外各组分别气管内滴注内毒素(lipopolysaccharide,LPS)(8 mg/kg),复制ALI模型。对照组在同样的条件下,向气管内注入等体积的生理盐水。

1.2.3 给药方法 预防组,在造模前3天灌胃给予牡丹皮水提物,每天一次,每次10 mL/kg。其它各组均在造模2小时后灌胃给药,治疗组给予10 mL/kg的牡丹皮水提物、地塞米松组给予地塞米松片2 mg/kg,对照组和模型组灌胃给予治疗组等量的生理盐水,各组给药5次,每次间隔约2小时。5组动物均在造模12小时后取材。

1.3 检测指标

1.3.1 肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中多形核白细胞(polymorphonuclear leukocytes,PMN)百分比各组动物随机取8只,以腹主动脉取血处死后,行气管插管。用磷酸缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)进行整肺灌洗,收集BALF,4℃,1300 rmp(离心10 分钟),收集上清液,-80℃保存,待测蛋白及细胞因子含量。沉淀细胞用PBS稀释混匀,进行细胞甩片(离心甩片机,1200 rmp,3分钟)做细胞涂片,姬姆萨(Gemsa)染色,显微镜下分类计数。

1.3.2 BALF中蛋白测定采用考马斯亮蓝法测BALF中蛋白浓度。

1.3.3 BALF中肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)及白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)检测用酶联免疫法测定TNF-α、IL-6的含量,严格按照试剂盒说明书操作。

1.3.4 肺组织病理形态学观察各组余下的3只大鼠处死后,取左肺叶,10%中性福尔马林固定48小时,常规石蜡包埋,切片,苏木精—伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE),光镜下观察肺形态学变化。

1.4 统计学分析

采用SPSS17.0统计软件进行分析,计量资料以均数±标准差±s)表示,采用单因素方差分析检验,各组间两两比较采用LSD方法,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠BALF中PMN百分比和蛋白浓度变化

模型组PMN百分比及蛋白含量均较对照组显著增加(P<0.01);地塞米松组、治疗组、预防组的PMN百分比及蛋白含量较模型组显著降低(P<0.05或P<0.01);预防组的指标值稍低于治疗组,但二者无显著差异,结果见表1。表明LPS可诱导大鼠肺部PMN大量活化、聚集,促进炎症的发生、发展;大鼠 BALF中蛋白含量急剧增多,说明LPS刺激后大鼠肺泡通透性增加,肺损伤较严重,这些指标均符合ALI的病理特征。另附细胞分类计数Gemsa染色涂片结果图,见图1。

2.2 各组大鼠BALF中TNF-α、IL-6的浓度变化

模型组BALF中TNF-α、IL-6浓度均明显高于对照组(P<0.01);地塞米松组、治疗组的TNF-α、IL-6浓度均较模型组显著降低(P<0.05或P<0.01);预防组的TNF-α浓度低于模型组(P<0.01),IL-6的浓度与模型组无差异,结果见表2。说明模型组大鼠的前炎性细胞因子含量显著增加,符合ALI早期的炎症反应,进一步表明用 LPS诱导 ALI模型较成功。

表1 各组大鼠BALF中PMN百分比和总蛋白浓度( ± s,n=9)

表1 各组大鼠BALF中PMN百分比和总蛋白浓度( ± s,n=9)

注:与模型组比较,a P<0.05,b P<0.01。

组别 BALF中PMN百分比﹙%﹚BALF中蛋白浓度(μg/mL)对照组 8.96±2.16b 83.76±30.04b模型组 87.20±1.22 379.08±47.91地塞米松组 44.25±17.32b 251.05±53.66b治疗组 65.76±1.64a 143.94±24.79b预防组 42.30±3.77b 105.44±31.39b

表2 各组大鼠BALF中TNF-α、IL-6的浓度(± s,n=9)

表2 各组大鼠BALF中TNF-α、IL-6的浓度(± s,n=9)

注:与模型组比较,a P<0.05、b P<0.01。

组别 TNF-α﹙pg/mL﹚ IL-6﹙pg/mL﹚对照组 10.44±1.09b 130.99±20.68b模型组 26.92±9.50 210.00±57.22阳性药组 12.52±2.27a 150.44±18.11b治疗组 10.97±2.99b 135.52 ±30.36b预防组 10.56±2.19b 205.60±15.15a

2.3 肺组织病理形态学变化

图1 大鼠BALF中PMN涂片观察结果﹙Gemsa染色﹚

光镜下见NS组:肺泡结构完整,大小均匀,肺泡腔清晰、壁薄,肺泡隔微血管、肺泡腔及间质隙内少量充血,未见肺水肿和炎性细胞浸润。模型组:肺泡结构破坏,肺泡腔变窄,肺泡间隔明显增厚,肺间质及肺泡充血、水肿、炎性细胞浸润,肺泡腔内有大量的红细胞及渗出物。与模型组比较,牡丹皮干预组和地塞米松组大鼠肺组织病变明显改善:肺组织病变局限且程度减轻,肺泡腔扩张,肺泡间隔增厚不明显,局部肺间质及肺泡充血、水肿、炎性细胞浸润,肺泡腔内红细胞及渗出物明显减少,另外阳性药组大鼠肺泡腔扩张更显著。结果见图2。

图2 大鼠肺组织病理学检查结果﹙HE染色,×100)

3 讨论

目前研究表明,肺内或全身过度活化的、失控性炎症反应是导致ALI/ARDS的主要原因。炎性细胞主要包括肺部中性粒细胞(又称多形核白细胞,polymorphonuclear,PMN)、肺单核巨噬细胞(alveolar macrophage,AM)和肺血管内皮细胞(pulmonary vascular endothelial cell,PVEC)等。机体受刺激后产生的大量前炎症介质(TNF-α、IL-1、IL-6等)及脂质代谢产物,促使炎症细胞(尤其是多形核白细胞及巨噬细胞)在肺组织的聚集、活化,构成了ALI炎性反应和免疫调节的“细胞网络”和“细胞因子网络”,继而形成炎症的“瀑布样”链锁反应,致使肺血管内皮和上皮细胞受到破坏,影响细胞间隙、钠水转运系统以及肺表面活性物质的产生,进而大量富含蛋白的液体进入肺组织,形成急性肺水肿,导致透明膜的形成以及肺泡的陷闭[5-6]。

LPS诱导ALI发生时的典型急性炎症反应,从中医温病角度看是“温邪犯肺”致热毒壅肺、血热郁滞的表现,热毒灼伤气津、煎熬血液,则见肺毛细血管瘀血、肺间质瘀血、液体细胞渗出、水肿、肺泡透明膜形成等[7-8],治疗时应用清热解毒、凉血散瘀、活血利水法[9]。牡丹皮作为传统的清热凉血药且具活血化瘀功效,常用来治疗热毒血症,故本研究从温病“热毒血症”切入,探讨牡丹皮对ALI的治疗作用。结果显示:ALI模型大鼠BALF中的PMN、蛋白浓度、TNF-α及IL-6水平在12小时急剧升高,说明ALI发生时肺内产生过度、活化的炎症反应,造成肺损伤。牡丹皮治疗及预防组大鼠BALF中的PMN数、蛋白浓度、TNF-α及IL-6水平显著降低,肺病变程度明显减轻,且与阳性药地塞米松组无显著性差异。说明牡丹皮通过抑制LPS诱导的中性粒细胞在肺内的聚集、活化,减少肺血管内皮细胞的损害,进而有效的抑制ALI时的炎症反应,减轻肺部损伤,对肺组织起到很好的保护作用。牡丹皮预防组大鼠的检测指标值稍低于治疗组,可能与牡丹皮提高免疫力、促进抗炎作用有关。本实验进一步说明清热凉血药牡丹皮可以有效地防治急性肺损伤,其机理可能与抑制中性粒细胞的过度活化,下调促炎因子的释放,减轻炎症的级联反应有关。

志谢 感谢北京中医药大学基础医学院李健副教授为本课题提供实验平台。

[1] 马李杰,李王平,金发光,等.急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征发病机制的研究进[J].中华肺部疾病杂志(电子版),2013,6(1):65-68.

[2] Bernard GR,Artigas A,Brigham KL,et al.The American-European Consensus Conference on ARDS.Definitions,mechanisms,relevant outcomes,and clinical trial coordination[J].American journal of respiratory and critical care medicine,1994,149(3):818-824.

[3] 李世林.牡丹皮镇痛抗炎作用的实验研究[J].中国中医基础医学杂志,2006,12(1):40-41.

[4] 樊金灼,杨明会,刘俊,等.凉血活血颗粒对急性放射病-肺损伤的保护作用[J].解放军药学学报,2011,27(6):484-486,526.

[5] 姚尚龙,张诗海,徐尤年.ALI/ARDS发病机制与治疗进展[J].中国继续医学教育,2011,3(10):63-77.

[6] Bian Z,Guo Y,Ha B,et al.Regulation of the inflammatory response:enhancing neutrophil infiltration under chronic inflammatory conditions[J].J Immunol,2012,188(2):844-853.

[7] 余林中,刘建新,胡孔,等.凉膈散对内毒素诱导大鼠急性肺损伤模型Toll样受体4表达的影响[J].中药新药与临床药理,2010,21(4):334-337.

[8] 李丽娜,王庆国.从气血水探讨急性肺损伤的中医病机[J].北京中医药大学学报,2008,31(5):296-298.

[9] 张广梅,李福安,童丽.热痛方对大鼠急性肺损伤保护作用的实验研究[J].青海医学院学报,2006,27(2):104-106.

猜你喜欢
牡丹皮肺泡炎症
脯氨酰顺反异构酶Pin 1和免疫炎症
经支气管肺泡灌洗术确诊新型冠状病毒肺炎1例
欢迎订阅《感染、炎症、修复》杂志
肺泡微石症并发气胸一例报道并文献复习
钙结合蛋白S100A8、S100A9在大鼠肺泡巨噬细胞中的表达及作用
牡丹皮软化切制工艺的优化
基于中药质量常数的牡丹皮饮片等级划分
类肺炎表现的肺泡细胞癌的临床分析
欢迎订阅《感染、炎症、修复》杂志
炎症小体与肾脏炎症研究进展