人参中人参皂苷类成分含量测定方法优化

郭凤霞 陈路晓 刘斌 姜艳艳

人参中人参皂苷类成分含量测定方法优化

郭凤霞 陈路晓 刘斌 姜艳艳

目的 优化人参中皂苷类成分人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1含量测定方法。方法 采用单因素考察方式,对提取方式、提取溶剂、溶剂倍量和提取时间4个因素进行考察,采用HPLC法测定人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1含量,分析比较含量测定结果。结果 人参中皂苷类成分含量测定供试品溶液制备最佳方法为采用50倍的70%甲醇回流提取人参2.5小时。结论 本实验所建立的方法操作简单、准确可靠、重现性好,为人参皂苷的含量测定提供较优方法。

人参皂苷; 含量测定; 优化

人参为五加科植物人参Panax gineseng C.A. Mey的干燥根和根茎,为常用名贵药材。人参具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津养血和安神益智的功效,临床上用于体虚欲脱,脾虚食少,肺虚喘咳,津伤口渴,气血亏虚。人参中主要含有皂苷、多糖、挥发油等化学成分[1],《中华人民共和国药典》(一部)[2]中,以人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1为含量测定指标性成分,对其进行质量控制。在《中华人民共和国药典》(一部)人参“含量测定”项下供试品溶液制备方法中,人参药材粉末采用氯仿连续回流提取,药渣挥去氯仿,再用水饱和正丁醇浸泡,放置过夜后超声处理提取皂苷类成分。《中华人民共和国药典》(一部)中规定人参中人参皂苷含量限度为含人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的总量不得少于 0.30%,人参皂苷 Rb1不得少于0.20%。

在采用人参含量测定项下方法进行供试品溶液制备时,发现该方法存在以下问题:(1)该方法中,氯仿回流提取的目的是为了除去脂溶性杂质,而实际工作中发现,人参药材粉末采用氯仿连续回流提取后,氯仿提取液几乎无色,且蒸干后残渣量很少,此步骤未除去脂溶性杂质;(2)采用水饱和正丁醇提取人参皂苷时,先放置过夜(约12小时),再超声处理,此过程所需时间太长,且无实际意义,故“放置过夜”步骤可以省略;超声处理提取皂苷类成分时,发现所得正丁醇提取液颜色较浅,溶液蒸干后,所得残渣量较少,且平行操作两份差距较大。综合分析实验现象和结果,并结合文献[3-5]中方法推测,采用正丁醇作为提取溶剂进行超声处理,未能把人参中皂苷类成分提取完全,故导致含量测定结果偏低且误差较大。其原因可能在于正丁醇为脂溶性有机溶剂,在提取过程中,不能有效穿透细胞膜,因而不能将皂苷类成分完全溶出。

中药指标性成分含量测定方法的正确性、合理性是中药质量控制和开发应用的基础。针对人参中人参皂苷类成分含量测定方法中供试品溶液制备过程的不合理问题,本文拟对人参中皂苷类成分含量测定中供试品制备方法进行优化,以保证人参含量测定结果的真实可靠,结果可信。改进后人参中皂苷类成分含量测定方法中供试品溶液制备方法简单、适用,结果准确可靠,重复性好,为人参科学的质量控制与评价及进一步开发应用提供科学依据。

1 材料与仪器

1.1 药材与试剂

人参药材购自河北安国药材市场(三批样批号分别是1:140201CP390,2:301002041,3:20140416,经北京中医药大学生药系张贵君教授鉴定为人参Panax ginseng C.A.Mey),甲醇、三氯甲烷、正丁醇、乙醇(分析纯,北京化工试剂厂),乙腈(色谱纯,塞默飞世尔科技有限公司),水(娃哈哈纯净水),人参皂苷Rg1对照品(中国食品药品检定研究院,批号: 110703-201529),人参皂苷Re对照品(中国食品药品检定研究院,批号:110754-201324),人参皂苷Rb1对照品(中国食品药品检定研究院,批号: 110704-201424)。

1.2 仪器

Waters 1525-2489高效液相色谱系统,Breeze2色谱工作站(美国Waters公司),Sartorius BT 25S型十万分之一电子分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司),EQ-100DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),HH-S2二孔智控水浴锅(郑州长城科工贸有限公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

参照《中华人民共和国药典》(一部)中人参含量测定项下方法色谱条件。SunFireC18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),检测波长:203 nm,流速:1.0 mL/min,流动相A为乙腈,B为水,按表1中规定进行梯度洗脱,理论板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于6000。

表1 流动相梯度洗脱表

2.2 对照品溶液的制备

精密称取人参皂苷Rg1对照品7.89 mg,人参皂苷Re对照品8.03 mg和人参皂苷 Rb1对照品8.61 mg,分别置于10 mL量瓶中,甲醇溶解、稀释至刻度,摇匀,作为对照品储备液。分别精密量取人参皂苷Rg1对照品储备液2.5mL,人参皂苷Re对照品储备液2.5 mL和人参皂苷Rb1对照品储备液2.3 mL,置于同一10 mL量瓶中,甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。

2.3 供试品溶液制备方法的建立

2.3.1 提取方式考察 (1)药典方法[2]:取人参药材粉末(过4号筛)1 g,精密称定,置索氏提取器中,加三氯甲烷,加热回流3小时,弃去三氯甲烷,药渣挥干溶剂,连同滤纸筒移入100 mL锥形瓶中,精密加入水饱和正丁醇50 mL,密塞,放置过夜,超声处理30分钟,过滤,取续滤液25 mL,置蒸发皿中蒸干,残渣加甲醇溶解,转溶至5mL量瓶中,稀释至刻度,摇匀,过0.45μm微孔滤膜,即得。

(2)回流提取:取人参药材粉末(过4号筛)1 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50 mL,密塞,称定重量,加热回流2小时,取出,密塞,放冷,补足减失的重量,摇匀,过滤,取续滤液25 mL,置蒸发皿中蒸干,残渣加甲醇溶解,转溶至5 mL量瓶中,稀释至刻度,摇匀,过0.45μm微孔滤膜,即得。

(3)超声处理:取人参药材粉末(过4号筛)1 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50 mL,密塞,称定重量,超声处理1小时,取出,密塞,放冷,补足减失的重量,摇匀,过滤,取续滤液25 mL,置蒸发皿中蒸干,残渣加甲醇溶解,转溶至5 mL量瓶中,稀释至刻度,摇匀,过0.45μm微孔滤膜,即得。

依上述色谱条件,精密吸取对照品溶液10μL和上述供试品溶液20μL,分别进样分析,测定色谱峰峰面积,计算含量。

由表2可见,采用回流提取方式,所测人参皂苷Rg1,人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的含量最高,故确定提取方式为回流提取。

表2 提取方式考察结果

2.3.2 提取溶剂考察 取人参药材粉末(过4号筛)1 g,精密称定,置具锥形瓶中,分别精密加入甲醇、70%甲醇、50%甲醇和乙醇50 mL,密塞,称定重量,加热回流2小时,取出,补足减失的重量,过滤,取续滤液25 mL,置蒸发皿中蒸干,残渣分别加甲醇、70%甲醇、50%甲醇和乙醇溶解,转溶至5 mL量瓶中,稀释至刻度,过0.45μm微孔滤膜,即得。

由表3可见,以70%甲醇作为提取溶剂,所测人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1含量高于其他提取溶剂结果,故选择提取溶剂为70%甲醇。

表3 提取溶剂考察结果

2.3.3 提取时间考察 取人参药材粉末(过4号筛)1 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,分别精密加入70%甲醇50 mL,称定重量,加热回流1小时,1.5小时,2小时,2.5小时,3小时,取出,放冷,补足减失的重量,过滤,取续滤液25 mL,置蒸发皿中蒸干,残渣加70%甲醇溶解,转溶至5 mL量瓶中,稀释至刻度,过0.45μm微孔滤膜,即得。

由表4可见,加热回流2.5小时后人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1总含量基本不再增加,故选用2.5小时作为提取时间。

表4 提取时间考察结果

2.3.4 溶剂倍量考察 取人参药材粉末(过4号筛)1 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,分别精密加入70%甲醇30 mL(30倍量),40 mL(40倍量),50 mL (50倍量),60 mL(60倍量),称定重量,加热回流2.5小时,取出,补足减失的重量,过滤,分别取续滤液15 mL、20 mL、25 mL、30 mL置蒸发皿中蒸干,残渣加70%甲醇溶解,转溶至5 mL量瓶中,稀释至刻度,过0.45μm微孔滤膜,即得。

表5数据说明,采用50倍和60倍70%甲醇提取,所测人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1总含量基本相当,故选择50倍作为提取倍量。

表5 溶剂倍量考察结果

综上,人参中皂苷类成分含量测定供试品溶液制备最佳方法为:取人参药材粉末(过4号筛)1 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇50 mL,密塞,称定重量,加热回流2.5小时,取出,密塞,放冷,补足减失的重量,摇匀,过滤,取续滤液25 mL,置蒸发皿中蒸干,残渣加甲醇溶解,转溶至5 mL量瓶中,稀释至刻度,摇匀,过0.45μm微孔滤膜,即得。

2.4 样品测定

取市售三批人参药材样品,按样品供试品溶液制备方法制备,测定色谱峰峰面积,计算含量。结果见表6。

表6 三批样品测定结果(n=3)

3 讨论

3.1 提取方式选择

通过比较药典方法、回流提取和超声处理的含量测定结果,发现药典方法测定结果明显偏低。采用回流提取不仅可以缩短样品处理时间,省去氯仿除杂环节,节省有机溶剂,减少实验步骤,同时可以提高人参皂苷提取率,保证实验结果的准确度和重复性。

3.2 提取溶剂选择

比较甲醇溶液提取与乙醇溶液提取的含量测定结果,乙醇提取率明显较低。进一步研究发现70%甲醇提取率略高于50%甲醇溶液提取率,且在实验中发现,采用50%甲醇作为提取溶剂,提取得到的水溶性杂质较多,故选择提取溶剂为70%甲醇溶液。

3.3 提取时间选择

比较1小时、1.5小时、2小时、2.5小时和3小时回流提取含量测定的结果,人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的含量基本不变,人参皂苷Rb1的含量随时间延长明显增加,2.5小时后基本不再增加,故选2.5小时作为提取时间。

3.4 溶剂倍量选择

实验中采用50倍量和60倍量70%甲醇提取时,人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1总含量大致相同,考虑节省成本,本实验采用50倍量70%甲醇提取。

此外,研究过程中还发现采用本方法处理样品,人参皂苷提取率会明显增加,若以此法测定人参中人参皂苷的含量,其含量限度的制订尚待进一步深入研究。

[1] 徐静,贾力,赵余庆.人参的化学成分与人参产品的质量评价[J].药物评价研究,2011,34(3):199-203.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社,2010:8.

[3] 曲帅.人参有效活性成分的提取分离及含量测定[D].长春:吉林大学,2013.

[4] 杨雨,郑斯文,金银萍,等.人参皂苷的提取分离方法研究进展[J].江苏农业科学,2014,42(5):214-217.

[5] 乔雪,李月茹.黑参中7种人参皂苷含量测定[J].人参研究, 2012,24(1):10-12.

Im provement in determ ination method for Ginsenosides in Ginseng

GUO Feng-xia,CHEN Lu-xiao, LIU Bin,et al.School ofChinese Pharmacy,Beijing University ofChinese Medicine,Beijing 100102,China Corresponding author:JIANG Yan-yan,E-mail:jyyjm1129@163.com

Objective To improve the determination method of ginsenoside Rg1,ginsenoside Reand ginsenoside Rb1in ginseng.M ethods Four factors including extraction method,extraction solvent, solvent volume and extraction time were studied through single-factor testmethod.And HPLCmethod was adopted to analyze the determination results of ginsenoside Rg1,ginsenoside Re and ginsenoside Rb1. Results The best sample preparation conditions for the content determination of ginsenosides were 50 times 70%methanol,reflux extraction and duration of 2.5 h.Conclusions The improved method is simple,accurate,and reproduciblewhich could supply a bettermethod for the contentdetermination ofginsenosides.

Ginsenosides; Determination; Improvement

R284.1

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.10.001

2015-05-28)

(本文编辑:董历华)

100102 北京中医药大学中药学院[郭凤霞(硕士研究生)、陈路晓(硕士研究生)、刘斌、姜艳艳]

郭凤霞(1990-),女,2014级在读硕士研究生。研究方向:中药药效物质基础研究。E-mail: gfx521713@163.com

姜艳艳(1980-),女,博士,副教授。研究方向:中药药效物质基础及质量控制方法研究。E-mail: jyyjm1129@163.com