Survivin、COX-2蛋白在骨肉瘤中的表达及其临床意义*

2015-03-24 07:03陕西省人民医院骨科西安710068
陕西医学杂志 2015年10期
关键词:组织化学软骨阳性率

陕西省人民医院骨科(西安710068)

段大鹏 秦 静 王晓庆 刘 军 范亚一 李 勇▲



Survivin、COX-2蛋白在骨肉瘤中的表达及其临床意义*

陕西省人民医院骨科(西安710068)

段大鹏 秦 静 王晓庆 刘 军 范亚一 李 勇▲

目的:检测骨肉瘤活检标本中COX-2与Survivin蛋白的表达水平,并分析其与骨肉瘤临床病理特征之间关系。方法:收集新鲜切除并经临床病理学确诊的骨肉瘤标本30例、骨软骨瘤标本20例。其中骨肉瘤标本按临床分期标准,Ⅰ期7例,Ⅱ期14例,Ⅲ期9例。采用免疫组织化学方法和Western blot法检测骨肉瘤组织、骨软骨瘤组织及正常组织中COX-2及Survivin蛋白表达。结果:Survivin 和COX-2蛋白主要表达于细胞质中,在骨肉瘤和骨软骨瘤组织中的表达分别为63.3%和73.3%、30.0%和25.0%;Spearman等级相关分析表明,在骨肉瘤组织中,Survivin与COX-2蛋白表达水平为正相关关系(r=0.775,P<0.05)。Western blot结果显示,骨肉瘤组织中Survivin和COX-2蛋白表达水平显著高于骨软骨瘤组织及正常组织组(P<0.05);SPSS13.0统计软件分析结果,未见Survivin和COX-2蛋白表达与骨肉瘤年龄、病理分级和类型之间存在显著相关性。结论:Survivin与COX-2蛋白在骨肉瘤组织中高表达,且二者呈正相关关系,表明Survivin与COX-2可能在骨肉瘤的发生发展中起重要作用。

骨肉瘤是儿童和青少年最常见的恶性骨肿瘤,患者常死于晚期远处转移,因此寻找一种能够指导临床治疗并提示预后的生物标志物非常重要[1]。Survivin为细胞凋亡抑制蛋白家族成员,在凋亡的基因调控中发挥重要作用[2]。COX-2常高表达于肉瘤组织,被认为是指导辅助治疗和判断预后的指标之一[3]。本研究采用免疫组织化学方法和Western blot法检测活检标本中COX-2与Survivin蛋白的表达,并分析其与骨肉瘤临床病理特征之间的关系。

材料与方法

1 材 料 收集我院2011年5月至2013年5月新鲜切除的肿瘤组织标本共50例,所有患者均知情同意。根据美国癌症联合委员会TNM分期系统进行分类。其中骨肉瘤标本30例,骨软骨瘤标本20例;男37例,女13例;年龄5~31岁,平均年龄13.25±3.22岁;按骨肉瘤临床分期标准,Ⅰ期7例,Ⅱ期14例,Ⅲ期9例。将所有外科手术切除的新鲜标本,冰盐水冲洗,切取数块,一部分放入冻存管立即置于-80℃冰箱中,另一部分放入70%冷乙醇中固定备用。

2 方 法 ①免疫组织化学染色:4%多聚甲醛常规固定,取材并置20%蔗糖溶液中过夜,蜡块制作、切片;0.3%过氧化氢甲醇溶液30 min,PBS清洗;加配好的0.3%Triton X-100 30 min,PBS清洗;加血清稀释液稀释的一抗,4℃ 24~48 h,吸去抗体,PBS清洗;加PBS稀释的的二抗,室温孵育2 h,PBS清洗;加ABC复合物,室温孵育2 h,PBS冲洗5 min×3,蒸馏水冲洗3遍;加显色液进行免疫组织化学显色,在显微镜下进行观察,待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液,用蒸馏水冲3遍,加PBS终止反应;梯度酒精脱水之后,封片、拍照。②Western blot法测定COX-2及Survivin蛋白表达:组织块用剪刀剪碎,加5倍冷提取液、150 mM NaCl、5 mM EDTA、1mM DTT、100 μg/ml PMSF、2 μg/ml Aprotinin、l% NP-40匀浆,冰浴30 min,将裂解液移至1.5 ml离心管中,1200 rpm离心5 min,取上清分装于0.5 ml离心管中,-20℃冻存;蛋白质定量,SDS-PAGE电泳,转膜,目的蛋白检测。条带的扫描数据用灰度值表示,并将同一样本的目标蛋白和内参蛋白所获数据进行比较得到相对表达值。

3 统计学方法 采用SPSS13.0软件包进行统计学处理,两组数据之间比较采用成组资料t检验,计数资料采用χ2检验,相关性用非参数Spearman等级相关检验分析,P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 免疫组织化学染色结果 见图1,表1。Survivin和COX-2蛋白主要在细胞质中表达,在骨肉瘤组织(OS)和骨软骨瘤组织(OC)中的表达分别为63.3%和73.3%、30.0%和25.0%,经检验差异有统计学意义(P<0.05)。

2 COX-2与Survivin蛋白表达的相关性分析 见表2。在30例骨肉瘤标本中,22例COX-2蛋白表达阳性的组织中16例Survivin蛋白表达阳性,8例COX-2阴性表达者中有3例Survivin表达阳性;COX-2阳性骨肉瘤组中,Survivin的阳性率为72.73%,显著高于COX-2阴性组37.50%。Spearman等级相关

注:A、B 为Survivin在OS和OC中表达;C、D为COX-2在OS和OC中表达

表1 Survivin、COX-2在骨肉瘤与骨软骨瘤中表达分析

注:与OC组比较,*P<0.05

分析表明,在骨肉瘤中Survivin和COX-2的表达呈正相关关系(r=0.775,P<0.05)。

表2 COX-2与Survivin在骨肉瘤组织中蛋白表达的相关性分析

注:两组相关性分析,P<0.05

3 Western blot法检测结果 见图2。骨肉瘤组织中Survivin和COX-2蛋白表达水平显著高于正常组织(CON组)、骨软骨瘤组织(P<0.05);Survivin和COX-2蛋白表达水平在正常组织、骨软骨瘤组织及骨肉瘤组织中呈逐渐升高趋势。

OS组与CON组及OC组相比,*P<0.05

图2 Survivin、COX-2蛋白在骨肉瘤与骨软骨瘤组织中表达水平

4 Survivin、COX-2蛋白表达与骨肉瘤临床病理特征的关系 见表3。 两者之间未见显著相关性(P>0.05)。

表3 Survivin、COX-2蛋白表达与骨肉瘤临床病理特征的关系分析

讨 论

Survivin为细胞凋亡抑制蛋白家族成员,在凋亡的基因调控中发挥重要作用,Survivin作用机制包括抑制细胞凋亡、调节细胞增殖、诱导血管生成等[4]。Survivin广泛表达于各种胚胎组织中,随胚胎的发育表达逐渐减少。研究发现Survivin与恶性肿瘤的发生、发展以及肿瘤敏感性有密切联系,已有很多关于Survivin基因与肿瘤关系的相关研究进行了深入的探索[5-6]。目前认为,Survivin引起肿瘤细胞凋亡的丧失与肿瘤的发生密切相关。本研究结果显示,Survivin蛋白在骨肉瘤组织、骨软骨瘤组织中都有不同程度的表达,表达的阳性率分别为63.3%和30%,而在正常组织中无表达,各组比较差异显著。Western blot结果显示,在骨肉瘤组织中Survivin蛋白表达的水平明显高于骨软骨瘤组织,在正常组织中未见表达。骨肉瘤组织、骨软骨瘤组织及正常组织之间的Survivin表达阳性率的差异具有统计学意义。综合以上研究结果可以看出,Survivin在骨肉瘤组织中高表达,对临床上骨肉瘤的诊断及判断复发具有一定的指导意义。

COX-2正常生理状态下在大多数组织中不表达或低表达,在炎症因子、生长因子、促癌剂等的诱导下迅速合成,参与多种病理生理过程。COX-2在恶性肿瘤中高表达,而COX-2抑制剂可抑制肿瘤细胞的增殖,促进其凋亡[7]。动物实验证明,COX-2过表达可导致肿瘤形成,COX-2抑制剂及敲除COX-2基因的小鼠肿瘤的发生率低于对照组。由此可见,COX-2在恶性肿瘤中高表达,在肿瘤发生发展中起重要作用[8]。本研究结果显示,COX-2蛋白在骨肉瘤组织、骨软骨瘤组织都有不同程度的表达,表达的阳性率分别为73.3%、25%,在正常组织中也有少量表达,各组比较差异由统计学意义。Western blot结果显示,COX-2蛋白在正常组织中表达较弱,在骨软骨瘤组织表达增强,而在骨肉瘤组织中强表达。骨肉瘤组织、骨软骨瘤组织及正常组织之间的Survivin表达阳性率差异显著。由此可见,COX-2在骨肉瘤组织中高表达,推测可能在骨肉瘤的发生发展起重要作用,有望在骨肉瘤治疗的治疗中起重要作用。

大量研究证实,COX-2通过促进细胞增殖、抑制凋亡、诱导新生血管形成而促进肿瘤的发生、发展,而Survivin做为新的抗凋亡基因与肿瘤细胞的增殖和血管生成密切相关,二者均与骨肉瘤的发生发展比且相关。本研究通过Spearman等级相关分析表明,在骨肉瘤组织中Survivin与COX-2蛋白表达之间具正相关关系。因此联合检测COX-2与Survivin对骨肉瘤恶性程度的判定、预后分析以及二者联合治疗提供理论依据,但其具体机制尚不完全清楚,有待进一步深入探索。

[1] Jemal A,Bray F,Center MM,etal.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.

[2] Asechi H,Hatano E,Nitta T,etal.Resistance to cisplatin-induced apoptosis via PI3K-dependent survivin expression in a rat hepatoma cell line[J].Int J Oncol,2010,37(1):89-96.

[3] Boulytcheva IV,Soloviev YN,Kushlinskii NE,etal. Expression of molecular markers in the tumor and survival prognosis in osteosarcoma[J].Bull Exp Biol Med,2010,150(2):237-242.

[4] 谈晓红,马 鹏.Survivin在胃粘膜癌变过程中的表达及与幽门螺杆菌感染关系探讨[J].陕西医学杂志, 2012,41(11):1457-1459.

[5] Zhang J,Zhu Z,Sun Z,etal.Survivin gene expression increases gastric cancer cell lymphatic metastasis by upregulating vascular endothelial growth factor-C expression levels[J].Mol Med Rep,2014,9(2):600-606.

[6] Chen Z, Liu N, Zhu G,etal. Targeting of the anti-apoptotic gene survivin in human thyroid carcinoma [J].Int J Mol Med,2012,30(3):465-472.

[7] Huang WC,Chai CY,Chen WC,etal.Histamine regulates cyclooxygenase 2 gene activation through Orai1-mediated NFκB activation in lung cancer cells[J].Cell Calcium,2011,50(1):27-35.

[8] Boulytcheva IV,Soloviev YN,Kushlinskii NE,etal.Expression of molecular markers in the tumor and survival prognosis in osteosarcoma[J].Bull Exp Biol Med,2010,150(2):237-242.

(收稿:2015-03-10)

Expression of Survivin and COX-2 in human osteosarcomas and its clinical significance

Department of Orthopaedics, Shaanxi Provincial People’s Hospital(Xi’an 710068)

Duan Dapeng Qin Jing Wang Xiaoqing et al

Objective:To investigate the expression of COX-2 and survivin and clinical significance in human osteosarcomas,and explore their correlation with the pathologic characters in patients with osteosarcomas tissue.Methods:Fifty freshly resected OS and OC samples were collected at the orthopedics department of three hospitals and were classified according to American Joint Committee on Cancer TNM staging system. There were 30 cases of OS tissues and 20 cases of OC tissues. All tumors and normal tissues were diagnosed by two independent gastroenterologists.The expression of COX-2 and survivin was assessed using immunohistochemical assay and Western blot assay in biopsy samples. Results:The IHC assays shown that the expression of COX-2 and survivin was mainly localized in the cytoplasm. The expression of COX-2 and survivin was respectively observed in 73.3% and 25.0% OS tissues and in 63.3% and 30.0% OC tissues,indicating their higher expression in OS compared with OC.Spearman rank correlation analysis showed a positive correlation between COX-2 and survivin expression in OS (r=0.775,P<0.05). The relationship between the expression of COX-2 and survivin and clinicopathologic features was analyzed. No significant correlation was found between the expression of COX-2 and survivin with age and pathological grade and types of OS.Conclusion:The higher expression of COX-2 and survivin in osteosarcoma and positive correlation between COX-2 and survivin suggesting that they may be provide a potential therapeutic strategy for the treatment in osteosarcoma.

Osteosarcoma Chondrosarcoma Cyclooxygenase 2 @Survivin

*陕西省社会发展科技攻关项目(2015SF051)

骨肉瘤 软骨肉瘤 环氧合酶2 @Survivin

R738.1

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.10.003

▲通讯作者

猜你喜欢
组织化学软骨阳性率
鞍区软骨黏液纤维瘤1例
髓外硬膜内软骨母细胞瘤1例
食管鳞状细胞癌中FOXC2、E-cadherin和vimentin的免疫组织化学表达及其与血管生成拟态的关系
不同类型标本不同时间微生物检验结果阳性率分析
原发肺软骨瘤1例报告并文献复习
大口黑鲈鳃黏液细胞的组织化学特征及5-HT免疫反应阳性细胞的分布
肌电图在肘管综合征中的诊断阳性率与鉴别诊断
免疫组织化学和免疫荧光染色在肾活检组织石蜡切片磷脂酶A2受体检测中的应用
鸭肝组织中DHBcAg表达水平定量免疫组织化学方法的建立
欧美的猫弓形虫感染情况及影响因素研究进展*