长链非编码RNA UCA1与miRNA-99b在膀胱癌细胞株和膀胱癌组织表达的相关性分析*

陕西省人民医院临床检验中心(西安710068)

谢小娟 潘晶晶△ 侯慧莲 李 旭 陈 葳△▲



长链非编码RNA UCA1与miRNA-99b在膀胱癌细胞株和膀胱癌组织表达的相关性分析*

陕西省人民医院临床检验中心(西安710068)

谢小娟 潘晶晶△侯慧莲 李 旭 陈 葳△▲

目的： 验证LncRNA UCA1与miRNA-99b的相关性。方法：采用荧光定量PCR法检测UCA1和miRNA-99b在过表达和敲低表达UCA1的膀胱癌细胞、膀胱癌组织中的表达。结果：在敲低UCA1表达的膀胱癌细胞5637中，UCA1表达下调60%，而miRNA-99b的表达上调250%；在过表达UCA1的膀胱癌细胞UMUC2中，UCA1表达上调410%，而miRNA-99b的表达下调60%；UCA1在膀胱癌中的表达水平明显高于癌旁组织(P<0.05)，而miRNA-99b在膀胱癌中的表达水平明显低于癌旁组织(P<0.05)；UCA1与miRNA-99b在膀胱癌组织中的表达呈负相关(R=-0.502,P<0.05)。结论：UCA1负向调节miRNA-99b的表达,但是它对miRNA-99b的调节在膀胱癌发生发展中的作用机制还需深入研究。

长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA),是一类转录本长度超过200nt的RNA分子；miRNA是高度保守的小非编码RNA,长度约20～25nt。最近许多研究表明LncRNA与miRNA之间可通过相互调控作用来影响肿瘤的发生发展。本实验室在2008年发现了一个与膀胱癌密切相关的LncRNA：UCA1(urothelial carcinoma associated 1)基因。为了找到UCA1基因可能调控的miRNA,本实验室通过对敲低UCA1表达的膀胱癌细胞株5637和对照细胞进行miRNA表达谱的高通量测序,发现在2个细胞差异表达的miRNA-99b与UCA1负相关。本研究采用荧光定量PCR技术检测UCA1和miRNA-99b在膀胱癌细胞和组织水平的表达,进一步验证两者的相关性。

材料与方法

1 材 料 膀胱癌细胞株(过表达UCA1的UMUC2、敲低表达UCA1的5637细胞)来自西安交通大学第一附属医院医学分子中心；膀胱癌组织选取2006年5月至2011年1月泌尿外科膀胱癌患者手术切除标本，经病理证实，膀胱癌和癌旁组织10对。采集前均经过医院伦理委员会批准及患者知情同意。术中取材,立即放入液氮中保存后,转入-80℃冰箱长期保存。

2 仪器与试剂 CO2培养箱(Model 3111,美国Thermo Forma公司)；RPMI 1640培养基(美国Gibco公司)；荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司,7300)；核酸蛋白浓度分析仪(美国Bio-Rad公司,SmartSpec Plus)；高速冷冻离心机(美国ThermoForma公司，D-37520)；-80℃冰箱(日本SANYO公司，MDF-U4186S)；逆转录试剂盒(美国Thermo公司)；定量PCR试剂(大连TaKaRa公司)；Trizol试剂(美国Invitrogen公司)。

3 引物设计 根据Gene Bank 中公布的基因序列设计UCA1引物序列(F：5′-CTCTCCATTGGGTTCACCATTC-3′；R：5′-GCGGCAGGTCTTAAGAGATGAG-3′)和内参基因β-actin(F：5′-TCCCTGGAGAAGAGCTACGA-3′；R：5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；miRNA-99b和内参基因U6的引物由广州市锐博生物科技有限公司设计合成,未提供引物序列。

4 方 法 ①细胞收集：用含10%小牛血清、150 μg/ml G418的RPMI 1640培养液培养5637和UMUC2细胞。当细胞生长良好,覆盖瓶底部约90%时,用1 ml Trizol溶液消化贴壁细胞，收集细胞后-80℃冻存备用。②RNA提取：按照Trizol试剂说明书提取组织和细胞RNA,-80℃保存备用。③逆转录cDNA合成：按照Thermo公司逆转录试剂盒说明书操作，-20℃保存备用。④荧光定量PCR：UCA1和β-actin基因PCR反应体系(25μl)：cDNA 2 μl、F(10mM) 1 μl、R(10mM)1μl、SYBY Green 12.5 μl、dd H2O 8.5 μl；反应条件：94℃ 5 min变性，94℃ 30s、59℃ 30s、72℃ 30s循环30 次，72℃ 5 min，4℃ ∞。miRNA-99b和U6基因PCR反应体系(20 μl)：cDNA 2 μl、F(10mM)0.8 μl、R(10mM)0.8 μl、SYBY Green 10 μl、dd H2O 6.4 μl；反应条件：94℃ 5 min变性，94℃ 30 s、59℃ 30 s，循环40 次，溶解曲线生成。每一标本重复操作3次，结果取均值。⑤基因表达水平计算：以2-△CT(△CT=标本目的基因CT值-标本内参基因CT值)表示样本中目的基因的相对表达量，△CT越高,表达量越低。

结 果

1 UCA1与miRNA-99b在敲低UCA1的膀胱癌细胞5637中的表达 见图1。在敲低UCA1表达的膀胱癌细胞5637(siRNA UCA1)及对照细胞(siRNA Con)中，UCA1表达下调60%,而miRNA-99b表达上调250%。

图1 UCA1与miRNA-99b在5637细胞中的表达

2 UCA1与miRNA-99b在过表达UCA1的膀胱癌细胞UMUC2中的表达 见图2。在过表达UCA1的膀胱癌细胞UMUC2(pCDNA3.1-UCA1)及对照细胞(pCDNA3.1)中，UCA1表达上调410%，而miRNA-99b的表达下调60%。

图2 UCA1与miRNA-99b在UMUC2细胞中的表达

3 UCA1与miRNA-99b在膀胱癌组织中的表达 见图3。UCA1在膀胱癌和癌旁组织中的相对表达量分别为(0.1129±0.1468)和(0.0030±0.0026)，差异有统计学意义(P<0.05)，即UCA1在膀胱癌中的表达明显高于癌旁组织；miRNA-99b在膀胱癌和癌旁组织中的相对表达量分别为(0.0045±0.0043)和(0.0644±0.0676)，差异有统计学意义(t=-2.74，P<0.05)，即miRNA-99b在膀胱癌中的表达明显低于癌旁组织。

图3 UCA1与miRNA-99b在膀胱癌及癌旁组织中的表达

4 UCA1与miRNA-99b在膀胱癌组织中的相关性分析 见图4。UCA1与miRNA-99b在膀胱组织中的表达呈负相关(R=-0.502，P<0.05)。

图4 两者在膀胱癌及癌旁组织中表达的相关性

讨 论

LncRNA不编码蛋白,而是以RNA的形式在表观遗传调控、转录调控、转录后调控等多种层面上调控基因的表达水平。生物信息学分析和实验证实UCA1是一个LncRNA。组织表达谱分析发现UCA1在人胚胎各组织中均有不同程度表达,而在绝大多数成人的正常组织中却不表达。在泌尿系统中,UCA1仅在膀胱癌组织中表达增高,在膀胱正常粘膜、前列腺增生组织和肾癌及相应的癌旁组织中均不表达,表明UCA1的表达具有时间及空间的特异性[1]。进一步研究发现,UCA1可以通过PI3K/Akt信号通路调节CREB的表达,进而影响肿瘤细胞周期[2]。同时,UCA1还能够调节与肿瘤发生及药物抵抗相关基因的表达。而UCA1调控膀胱癌发生发展的具体作用机制还有待深入研究。

miRNA是广泛存在于各种生物体中高度保守的非蛋白编码的小RNA。目前各种研究发现，miRNA几乎参与了所有生命活动过程的调节，并在肿瘤的发生、发展中起重要作用。多项研究表明，miRNA-99b是一个抑癌基因。miRNA-99b调节细胞增殖和转移，参与AKT/mTOR信号通路；通过靶向多个基因，如IGF1R、mTOR、AKT1等调节AKT/mTOR信号通路。通过调节AKT/mTOR信号通路，促进皮肤伤口愈合[3]，抑制宫颈癌细胞增殖[4]；通过靶向mTOR，增加胰腺癌的放疗抵抗力[5]。作为一个抑癌基因，直接靶向FGFR3抑制非小细胞肺癌[6]，同时还能抑制前列腺特异性抗原PSA和前列腺癌细胞[7]

最近许多针对LncRNA与肿瘤等疾病的研究表明,LncRNA与miRNA之间可通过相互调控作用来影响肿瘤的形成和进展。LncRNA可以作为ceRNA与其它RNA转录本竞争相同的miRNA,从而实现相互间的交流与调节。近期在关于RNA转录本之间互相作用的研究中，提出了一种作为全新基因表达调控模式的ceRNA假说：即LncRNA或mRNA假基因转录物可以作为ceRNA，通过miRNA应答元件(miRNA response element，MRE)竞争结合具有相同MRE的miRNA来调控基因的表达水平，从而影响细胞的功能[8-9]。Cesana等在研究人和鼠的骨骼肌分化过程中，发现具有MRE转录本的LncRNA可以竞争性结合miRNA，调控miRNA及其靶基因的表达,同时也受miRNA的调控[10]。

高通量测序发现miRNA-99b在敲低UCA1表达的膀胱癌细胞5637及对照细胞中的标准化表达量分别为17.4和61.2，即下调UCA1的表达，miRNA-99b表达上调2.5倍。为了进一步验证测序的结果,本课题分别在膀胱癌细胞和组织水平对两者的相关性进行了验证，发现随着UCA1表达的升高，miRNA-99b表达下降，即两者负相关，UCA1调节miRNA-99b的表达。UCA1作为一个与膀胱癌密切相关的基因，miRNA-99b作为一个肿瘤抑制基因，UCA1调节miRNA-99b在膀胱癌发生发展中的作用还有待深入研究。

[1] Xie XJ,Li X,Wang F,etal.Cellular localization and tissue expression pattern of UCA1, a non-coding RNA[J].Journal of Southern Medical University,2010,30(1)：57-60.

[2] Yang C,Li X, Wang Y,etal.Long non-coding RNA UCA1 regulated cell cycle distribution via CREB through P13-K dependent pathway in bladder carcinoma cells[J].Gene,2012,496(1)：8-16.

[3] Jin Y,Tymen SD,Chen D,etal.MicroRNA-99 family targets AKT/mTOR signaling pathway in dermal wound healing [J].PLoS One,2013,8(5)：e64434.

[4] Wang L, Chang L,Li Z,etal.miR-99a and -99b inhibit cervical cancer cell proliferation and invasion by targeting mTOR signaling pathway [J].Med Oncol,2014,31(5)：934.

[5] Wei F,Liu Y,Guo Y,etal.miR-99b-targeted mTOR induction contributes to irradiation resistance in pancreatic cancer[J].Mol Cancer,2013,25(12)：81.

[6] Li Z,Li X,Wu S,etal.Long non-coding RNA UCA1 promotes glycolysis by upregulating hexokinase 2 through the mTOR-STAT3/microRNA143 pathway[J].Cancer Sci,2014,105(8)：951-955.

[7] Sun D,Lee YS,Malhotra A,etal.miR-99 family of MicroRNAs suppresses the expression of prostate-specific antigen and prostate cancer cell proliferation[J].Cancer Res,2011,71(4)：1313-1324.

[8] Salmena L,Poliseno L,Tay Y,etal.A ceRNA hypothesis: the Rosetta Stone of a hidden RNA language [J].Cell,2011,146：353-358.

[9] 涂海峰,武明花,李桂源.lncRNA与miRNA相互调控作用及其与肿瘤的关系[J].中国生物化学与分子生物学报, 2013,29(11)：1029-1034.

[10] Cesana M,Cacchiarelli D,Legnini I,etal.A ong noncoding RNA controls muscle differentiation by functioning as a competing endogenous RNA[J].Cell,2011,147(2)：358-369.

(收稿：2015-04-20)

Correlation analysis of long non-coding RNA UCA1 and miRNA-99b in bladder carcinoma cells and tissues

Center for Clinical Laboratory,Shaanxi Provincial People’s Hospital(Xi’an 710068)

Xie Xiaojuan Pan Jingjing Hou Huilian et al

Objective：To confirm the correlation of LncRNA UCA1 and miRNA-99b.Methods：UCA1 and miRNA-99b were assessed in bladder carcinoma celles with over expression and knockdown of UCA1, and bladder carcinoma tissues. Results: UCA1 was down-regulation by 60%,while miRNA-99b was up-regulation by 250% in bladder carcinoma cell 5637 with knockdown of UCA1. UCA1 was up-regulation by 410%,while miRNA-99b was down-regulation by 60% in bladder carcinoma cell UMUC2 with over expression of UCA1. UCA1 was significantly increased in bladder carcinoma tissues compared with adjacent carcinoma tissues (P<0.05),but miRNA-99b was completely opposite(P<0.05)；The correlation of UCA1 and miRNA-99b in bladder carcinoma tissues was analysised(R=-0.502,P<0.05).Conclusion：UCA1 is negative regulating the expression of miRNA-99b,but it's to be researched in further of the correlation of UCA1 and miRNA-99b in the mechanism of bladder tumorous development.

Urinary bladder neoplasms RNA,long noncoding Gene expression regulation,neoplastic @UCA1 @miRNA-99b

*国家自然科学基金面上项目(81372151)

膀胱肿瘤 RNA,长链非编码 基因表达调控,肿瘤 @UCA1 @miRNA-99b

R737.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.10.002

△西安交通大学第一附属医院检验科

▲通讯作者