肠道氨基酸和小肽转运载体的基因表达、影响因素与分子调控机制

黄薪蓓 许庆彪 刘建新

(浙江大学动物科学学院奶业科学研究所，动物分子营养学教育部重点实验室，杭州 310058)

饲粮来源氨基酸、脂肪酸和碳水化合物为动物体提供必需的营养物质，其吸收受多种机制的调节以保持稳衡。很长一段时间，人们相信蛋白质在肠腔被完全水解成氨基酸，然后通过氨基酸转运载体吸收入机体。然而，在20世纪70年代，研究发现含2个和3个氨基酸的小肽是蛋白质水解的主要产物［1］，随后开始了相应转运系统的研究。迄今已有许多试验证明肠道氨基酸转运载体和小肽转运载体的存在，它们的表达及转运功能受许多因素的调节，包括饲粮、发育、激素、microRNAs(miRNAs)以及其他一些蛋白因子。由于反刍动物消化道结构的特殊性，其氨基酸和肽的转运更为复杂。因此，阐明肠道氨基酸和肽转运及其调节机制有助于更清楚了解肠道蛋白质的消化和吸收过程，为生产实践提供理论依据。

1 肠道小肽和氨基酸转运系统

肠道氨基酸的转运受氨基酸转运载体调节，而小肽的吸收则受小肽转运载体(PepT1和PepT2)的调节。氨基酸的转运存在底物专一性，但是小肽转运不存在这种专一性，PepT1可以转运400种二肽和8 000种三肽，并且转运1个二肽或三肽所需能量与1个游离的氨基酸是一样的。迄今为止，已发现多种小肽转运载体(H+依赖型和非H+依赖型)、8种氨基酸转运系统和1种H+依赖型的氨基酸转运载体。多种载体在肠道基底膜和刷状黏膜表达，一部分仅在其他器官表达。

1.1 小肽转运载体

目前研究最多的小肽转运载体是PepT1和PepT2。Chen等［2］通过试验证实了小肽转运载体在羊、牛、猪和鸡等家养动物的组织分布，开拓了营养生理的新领域。2种小肽转运载体(PepT1和PepT2)的cDNAs序列已经被测定，功能分析表明2种载体具有不同的底物亲和性和特异性。PepT1和PepT2的组织分布也存在差异:PepT1主要在肠道表达，在反刍动物的瘤胃和瓣胃也有表达［3］，而PepT2主要在肾脏表达。小肽转运载体是质子依赖性的，例如PepT1吸收了肽和H+后，质子被钠氢交换器转出细胞，胞内的Na+再被钠钾交换器转出，转出 3个 Na+，转入 2个 K+以恢复电化学梯度。

1.2 氨基酸转运系统

近年来氨基酸转运载体的研究取得了显著进展，目前已鉴定出的包括6类阴性、4类阳性、11类中性以及5类兼性氨基酸转运载体。氨基酸的转运被称为“系统转运”，表明各种细胞类型的转运活动相似。氨基酸转运载体有系统命名，如中性氨基酸转运系统(L、A和ASC系统)、酸性氨基酸转运系统(系统)、碱性氨基酸转运系统(y+系统)和一些特殊的氨基酸转运载体(L和T系统)。两性氨基酸转运载体有3种:丙氨酸/丝氨酸/半胱氨酸/苏氨酸转运蛋白(ASCT)1、ASCT2和B0，其中B0主要在上皮中表达，只依赖Na+而不需要与K+相互作用。氨基酸转运载体y+L和b0，+的蛋白链 rBAT、b0，+AT、4F2hc 和 y+LAT1 在肠道都有分布，是非Na+依赖型的碱性及两性氨基酸转运载体，依靠氨基酸交换进行。酸性氨基酸转运载体有5种:兴奋性氨基酸转运蛋白(EAAT)1～5，其中EAAT3主要在肠上皮细胞表达;EAAT是Na+共转运载体，在转运过程中同时需要偶联K+的反向转运。碱性氨基酸转运载体在家养动物中研究较多，主要是由于其与赖氨酸的吸收转运有关。y+转运系统是细胞中为数极少的单向转运系统，位于上皮细胞基底部，其驱动力主要是膜两侧的电势梯度。y+系统有4个氨基酸转运蛋白:阳离子氨基酸转运蛋白(CAT)1、CAT2、CAT2a和CAT3，CAT1是多种细胞中最主要的y+系统转运蛋白，几乎在所有的组织中存在(除肝脏外)，而肝脏仅表达 CAT2a［4］。

2 小肽和氨基酸转运载体基因表达调节的分子机制

某些氨基酸(亮氨酸和苯丙氨酸)能通过氨基酸反应元素(AARE)介导来控制鼠PepT1的启动子活性。AARE样模体位于起始密码子上游，并且与天冬酰胺合成酶的AARE有较高同源性，位于起始密码子上游有一个尾侧型同源转录因子2(Cdx2)结合位点。对鼠启动子的系统分析，发现了转录起始位点上游内的相关顺式和反式元素，包括连接转录因子Sp1的3个GC盒子［5］，它们的直接作用是对哺乳动物PepT1表达的调节。有研究报道，肠道PepT1的表达受Cdx2的调控，尽管Cdx2的结合位点还不确定，而Cdx2的结合依赖于转录因子 Sp1 以及丁酸盐［6-7］。Saito 等［8］发现小鼠PepT1转录的节律性调节依靠时钟基因控制的白蛋白D位点结合蛋白。

氨基酸转运载体的mRNA转录需要第1外显子处的1个氨基酸反应元素，此外，还受转录因子蛋白激酶GCN2(使真核启动因子2α磷酸化)的激活，表明有新翻译的转录因子参与转录。氨基酸饥饿时，3＇末端非编码区远端片段内RNA结合蛋白(HuR)定位发生改变，导致氨基酸转运载体的mRNA稳定性增加，但HuR的细胞质定位的机制尚不清楚，该反应的氨基酸特异性也不清楚，可能与AMP激酶有关。氨基酸转运载体mRNA的翻译从一个5＇末端非编码区的内部核糖体进入位点(IRES)开始，其有效的翻译还要求真核启动因子2α的磷酸化，通过转录因子蛋白激酶GCN2、蛋白激酶样的内质网激酶或者双链RNA依赖蛋白激酶起作用，而IRES的调节活动依赖于一个位于5＇末端非编码区的上游开放读码框(48个氨基酸的IORF)和IRES的重叠部分［9］。氨基酸饥饿通过真核启动因子2α磷酸化起作用，由此推测引起真核启动因子2α磷酸化的物质都可以诱导氨基酸转运载体的IRES活性，内质网应激可以引起其IRES活性增加验证了这一推测。所以营养缺乏，像氨基酸和葡萄糖不足(会引起内质网应激)，会激活下游目标氨基酸合成基因、氨基酸转运载体基因和转录因子等的信号通路［10］。不仅如此，许多证据表明氨基酸转运载体蛋白可在翻译后被调节，激活的蛋白激酶C致其转录活性显著下调，这个过程是由转运载体的内化引起，不是直接磷酸化的结果，但其具体机制还不清楚。小肽和氨基酸转运载体的表达调节分子机制多在试验动物上研究，对于农业动物的研究较少，并且其表达受许多因素的影响，相对应的各种调节机制仍未完全清楚。

3 影响小肽和氨基酸转运载体表达的因素

3.1 发育过程

在不同的发育阶段，动物肠道小肽和氨基酸转运载体的表达不同。Guandalini等［11］发现新生儿肠道更易吸收小肽。大鼠出生4 d后PepT1的mRNA水平显著增加，而后开始下降，在28 d达到成年水平。近年的研究表明，大鼠十二指肠、空肠、回肠PepT1的mRNA表达量在出生后第3～5天达到最大，然后下降，而断奶时(第24天)会出现短暂的上升。但Rome等［12］报道PepT1在小肠的表达不随大鼠的年龄变化而变化。有学者认为，饲粮蛋白质和一些神经激素(甲状腺素、胰岛素和糖皮质激素等)可能参与了PepT1在发育阶段的表达调控，但具体机制仍不清楚，需要进一步深入研究。

Buddington等［13］研究发现，猪的氨基酸吸收率从出生开始逐渐下降，24 h下降30%，可能原因是氨基酸转运蛋白下降、转运载体周转速率变化以及不同氨基酸转运载体的替换。同时氨基酸转运载体随着发育变化，与物种及载体本身密切相关。Liao等［14］发现牛不同发育阶段的CAT1在肠道的表达有所不同，在生长期空肠CAT1的mRNA表达丰度显著高于哺乳、断奶和育肥期，且显著高于十二指肠和回肠;在其他3个阶段不同肠段间CAT1的mRNA表达丰度差异不显著，表明CAT1介导的碱性氨基酸吸收最大量出现在肉牛的生长阶段。Feng等［15］对猪肠道不同时期 b0，+AT 和y+LAT1的mRNA表达变化规律进行研究，发现mRNA丰度随日龄呈线性增加，可能与饲粮的改变及氨基酸需求量增加有关。综上所述，随着肠道组织总重量增加，氨基酸转运载体总体转运能力增强，而单位面积肠道组织对大部分氨基酸的转运能力则是下降的。目前的研究仅限于几种氨基酸转运载体，还有很多重要的氨基酸转运载体有待进一步研究，尤其是反刍动物。

3.2 跨膜质子流及细胞内p H

PepT1的转运功能依赖跨膜质子梯度以及内部的负膜电位。野生型鼠试验发现，吸收甘氨酸-肌氨酸二肽后肠上皮细胞内pH降低，而PepT1缺失鼠则无此现象，表明PepT1具有酸转运载体的功能［16］。为了防止细胞酸化，Na+/H+交换器排出中性的质子交换细胞外的Na+。PepT1对其他质子依赖性营养物质的转运也有调节作用，PepT1表达减少可导致细胞内pH升高，从而增加脂肪沉积［17］。然 而，Kolodziejczak 等［18］研 究 发 现，给PepT1缺失小鼠饲喂高脂肪饲粮，由于PepT1的缺失可导致小鼠不能通过增加绒毛长度和面积来适应高脂肪的饲粮，日增重和脂肪沉积都显著减少，其影响结果可能取决于PepT1减少的程度，但可以确定的是，PepT1的正常工作依赖于细胞内适宜的pH。

Na+依赖的氨基酸转运载体不受pH变化的影响，如精氨酸的转运受赖氨酸、鸟氨酸或者高精氨酸的调节，其他相关的研究还比较欠缺。肾上皮细胞的ASCT2具有Na+依赖性，用Li+替代Na+时表现出较低的耐受性，中性氨基酸和谷氨酸盐在pH为7时达到最大转运水平［19］。

3.3 激素和蛋白因子

PepT1的表达丰度和活性受到激素的调节，比如胰岛素、瘦素、生长激素以及甲状腺激素。用胰岛素处理Caco-2细胞，二肽的摄入会增加，Vmax增加而Km不变，说明胰岛素是通过增加PepT1的丰度来提高二肽摄入量的。肠腔内的瘦素可以促进小肽的吸收［21］，它们并非在转录水平上改变PepT1的转运活性，具体机制尚不清楚。Avissar等［22］发现生长激素和表皮生长因子也可促进PepT1的mRNA在空肠的表达丰度。Ashida等［23］用三碘甲状腺原氨酸(T3)处理Caco-2细胞后，PepT1的mRNA丰度和蛋白质数量都显著减少，可能是T3使PepT1的mRNA的转录或稳定性下降，其机理可能是与细胞核靶基因调节区域的甲状腺激素反应元件(TRE)相互作用，形成甲状腺受体复合物间接地影响其转录。蛋白激酶C(PKC)和环化腺苷酸(cAMP)也可调节PepT1的表达，但还不清楚这种调节是通过特异基因相互作用、细胞信号或转运载体的功能起作用，还是激素来本身调节而实现。

氨基酸转运载体的表达受许多蛋白因子的影响。用血小板生长因子(PDGF)、溶血卵磷脂(LPC)、转化生长因子β(TGF-β)短期处理均可以下调CAT的转运。然而，是否由于CAT的表达量降低还有待证明，也可能是由于亚细胞定位、转运活性或者底物亲和力的改变引起。Uchiyama等［24］在Caco-2细胞上的研究发现，S-亚硝基-N-乙酰-DL-青霉胺可通过从头合成增加ASCT2的蛋白质表达量。Fanjul等［25］的试验表明，瘦素可以控制ASCT2和B0AT1的活性。氨基酸转运载体种类众多，当前的研究仅限于某几种氨基酸，尚需深入研究以发现更多的影响因子。

3.4 miRNAs

miRNAs是转录后抑制目标基因表达的非编码RNAs，最近发现它们有许多细胞功能，在哺乳动物中，miRNAs控制着将近30%的蛋白质编码基因，几乎参与所有细胞进程的调控，许多miRNAs具有组织表达特异性，而且它们的表达形式可导致器官蛋白质图谱出现特异。在肠道上皮分化期间miR-194发生上调，miR-7也对肠道上皮细胞的分化起作用［26-27］。Dalmasso 等［28］以 Caco-2 细胞系为模型，发现在上皮细胞分化期间PepT1的表达水平与成熟的miR-92b呈负相关，并且从转录和翻译水平进行调节，其机理是作用于PepT1的3＇端的非翻译区。

氨基酸转运载体也受miRNAs的调节，在肝细胞中，miR-122可能下调高亲和力的碱性氨基酸转运载体CAT1，靶向结合mRNAs的3’端的非翻译区阻止蛋白质的积累，其机制是抑制转录或诱导mRNAs的降解［29］。作为新的调控因子，miRNA的研究还处于初级阶段，尤其在农业动物上的研究更为有限，对肠道氨基酸和小肽转运载体的调节方面的研究也很欠缺，值得深入探索其调控途径和分子机制。

4 饲粮氮水平对小肽和氨基酸转运载体的调控作用

众所周知，肠道营养物质转运载体的表达和功能由营养供应引发与调控。氨基酸是细胞合成小肽和蛋白质的前体物质，因此肠腔内氨基酸以小肽的形式吸收的量与氨基酸或小肽的浓度密切相关。从畜牧业的角度来看，饲粮蛋白质资源不足且较为昂贵，其利用率即使较小幅度的改善也可有效提高经济效益，并减少氮的排放，改善环境。

4.1 低氮水平

Ogihara等［30］利用免疫荧光染色进行免疫印迹和图像分析检测了饲粮氨基酸添加及饥饿对小鼠空肠PepT1表达的影响，发现饥饿显著增加PepT1载体蛋白的表达量。此外，多种动物试验表明，短期禁食可以增加小肽转运载体的表达量，这依赖于过氧化物酶体增殖因子激活受体α(PPARα)。给 PPARα缺失小鼠短期禁食时，PepT1载体蛋白的表达量与自由采食的小鼠相比没有差异;在鼠禁食1 d后可增加二肽的转运，其机制可能是增加了 PepT1基因表达［31］。Gilbert等［32］给鸡饲喂低蛋白质饲粮，3～7 d PepT1表达量减少，7～14 d表达量增加。Hatzoglou等［33］发现给大鼠禁食氨基酸不仅可增加CAT1的转录水平，还提高了mRNA的稳定性和翻译水平。

4.2 高氮水平

Walker等［34］利用 Caco-2 细胞系试验发现，添加小肽可增加PepT1 mRNA的表达量。Ferraris等［35］给鼠饲喂高蛋白质饲粮，发现空肠对二肽的转运能力增强。在鸡的试验中得到了相似结果，增加饲粮中的蛋白质含量，PepT1 mRNA表达量从3～14 d持续增加。

氨基酸的转运依赖底物特异性的不同转运系统。b0，+系统通过亮氨酸交换来转运赖氨酸，饲粮中亮氨酸的浓度会影响碱性氨基酸的吸收。García-Villalobos等［36］在赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸缺乏的饲粮中添加相应氨基酸增加了空肠中b0，+的表达量，血清中的赖氨酸浓度升高;Morales等［37］发现在生长猪的饲粮中额外添加亮氨酸影响b0，+在空肠的表达量;He 等［38］在断奶仔猪的饲粮中添加赖氨酸，显著增加了空肠肠绒毛的高度和隐窝的深度，b0，+AT和y+LAT1的mRNA表达量也显著升高。而Liao等［39］发现，增加肠腔微生物蛋白产量会降低肠细胞顶膜和底膜对碱性氨基酸的转运能力。饲粮赖氨酸含量选择性地影响小肠碱性氨基酸转运载体的表达，从而影响其对赖氨酸和其他必需氨基酸的吸收，但其具体的调节机制还有待深入研究。值得注意的是，由于氨基酸转运载体依赖离子交换进行转运，小肽转运入细胞水解成大量氨基酸可以促进氨基酸的转运，游离氨基酸的吸收受PepT1的间接调控。Wenzel等［40］研究发现，二肽的吸收可促进 bo，+系统对氨基酸的吸收。

这些结果表明，蛋白质的消化产物可以作为代谢信号调节PepT1基因的转录，底物过量或缺少都会增加PepT1基因的表达。当底物浓度较高时会增加载体的表达以充分吸收利用底物，而在低浓度时，作为补偿机制增加载体表达。氨基酸的情况则比较复杂，因为可以用作能量来源，一些氨基酸对某种细胞更为重要或毒性作用更强，并且一些氨基酸转运载体转运相同的底物，而一些则同时转运必需和非必需氨基酸，因此很难预测添加或缺少某种氨基酸对转运载体的影响作用。

5 小结

近年来，氨基酸和小肽转运载体被成功克隆表达，其分子结构、组织分布和功能也得到了大量研究，为蛋白质营养的研究开辟了广阔的空间。深入探讨影响其基因表达和功能的因素及其作用机制，可以更好地应用其独特的生物学功能，在生理学研究和动物生产实践上都有重要的意义。虽然对于氨基酸和小肽转运载体活性的调节因素已有了不少研究，但其分子水平上的调节机制依然不是很清楚。同时研究多局限于试验动物及在人类的生物制药开发应用方面，而对于为人类提供肉、蛋、奶等畜禽类的研究还比较缺乏，尤其是在反刍动物方面的报道更为少见，值得深入研究。

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