细菌在氨基酸首过肠道代谢中的作用

杨宇翔 慕春龙 朱伟云

(南京农业大学消化道微生物研究室，南京 210095)

单胃动物的肠道中定植着大量的细菌，其数量大约是宿主机体细胞总数的10倍。肠道细菌在体内作为独立的一个“器官”，对宿主健康及肠道免疫起重要作用［1］。近年来研究表明，肠道细菌参与肠道中营养素的代谢，尤其是氨基酸。Stoll等［2］的研究表明，饲粮中有30%～60%的必需氨基酸在首过肠道代谢中被肠上皮细胞分解利用。然而，Chen等［3］通过体外培养发现，猪小肠上皮细胞只能代谢支链氨基酸，无法氧化其他必需氨基酸，故作者推测氨基酸在首过肠道代谢中的分解很有可能是肠道细菌的作用。本实验室先前通过体外培养研究证明了以下观点:来自猪小肠的肠腔细菌具有降解必需氨基酸的能力［4］。此外，我们近期的研究还发现，肠腔细菌与肠壁附着细菌对氨基酸的代谢表现出不同的能力［5］。因此，本文综述了小肠细菌在氨基酸首过肠道代谢中的作用，以及氨基酸在小肠细菌代谢中的去路。

1 小肠细菌参与氨基酸首过肠道代谢

饲粮和内源分泌的蛋白质进入小肠后，被来源于宿主和细菌的蛋白酶、肽酶消化，生成的小肽进一步在小肠上皮细胞内分解，生成寡肽和氨基酸。这些寡肽和氨基酸可以被刷状缘上的转运载体从肠腔转运至血液中［6］。然而，在仔猪上的研究发现，大量的饲粮氨基酸不能吸收入血从而供机体利用，其中有30%～60%的必需氨基酸被门静脉排流组织(portal-drained viscera，PDV)截取［2］。已有的研究表明，小肠上皮细胞可以降解非必需氨基酸［2］。已有研究显示，猪小肠上皮细胞能够大量代谢支链氨基酸，但是缺乏分解代谢其他必需氨基酸的酶，如苏氨酸脱氢酶、组氨酸脱羧酶和苯丙氨酸羟化酶等［3，7］，故有推测，细菌可能介导了小肠对饲粮氨基酸的首过代谢。

赖氨酸在体外培养的仔猪肠道上皮细胞中几乎不被氧化［7］，然而约有35%的饲粮赖氨酸在首过肠道代谢中消失，其中只有18%用来合成黏膜蛋白质［2］。在体外培养中，仔猪肠道上皮细胞不能代谢蛋氨酸和苯丙氨酸［7］，然而有报道表明仔猪肠道内可以代谢约20%的饲粮蛋氨酸［8］以及约35%的苯丙氨酸［2］。这些报道证明蛋氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸的首过肠道代谢很有可能是细菌的作用。

本实验室先前的研究利用厌氧培养技术，研究了猪小肠细菌对游离氨基酸的代谢。试验表明，十二指肠、空肠和回肠细菌能大量代谢必需氨基酸［4］。根据培养基中氨基酸的消失率，可分为3组。赖氨酸、苏氨酸、精氨酸、谷氨酸、亮氨酸属于高消失率组，24 h的消失率在90%以上;异亮氨酸、缬氨酸和组氨酸属于中等消失率组，24 h的消失率在50%～80%之间;而脯氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和色氨酸属于低消失率组，24 h消失率低于35%。继代培养30代后，小肠细菌仍能大量代谢赖氨酸、苏氨酸、精氨酸和谷氨酸，其24 h消失率均在50%以上［4］。而组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的消失率显著下降，培养30代后氨基酸的24 h的消失率在30%左右。这些研究均证实，细菌的确参与了氨基酸的肠道首过代谢。

2 肠道中的氨基酸代谢细菌

氨基酸利用菌广泛存在于人和动物的消化道中。近几十年来的研究主要集中在细菌在后肠对氨基酸的发酵上。氨基酸的发酵产物主要包括氨类物质、生物胺、酚及吲哚类物质。产生这些代谢物的细菌主要有拟杆菌(Bacteroides spp.，spp.为该属的某些种)、丙酸杆菌(Propionibacterium spp.)、链球菌属(Streptococcus)和梭菌属(Clostridium)［9］。梭菌属的细菌包括 Clostridium spp.、梭杆菌(Fusobacterium spp.)、消化链球菌(Peptostreptococcus spp.)、韦 荣 氏 球 菌 (Veillonella spp.)、埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)、发酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)及反刍月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)等，它们被认为是单胃动物后肠中主要的氨基酸发酵细菌。对于小肠，本实验室结合基于16S rDNA基因的PCR-变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术和传统的分离培养技术，首次对猪小肠中氨基酸代谢菌群展开了系统分析，比较了猪小肠中代谢不同氨基酸的细菌区系，发现猪小肠代谢氨基酸的优势细菌包括克雷伯菌(Klebsiella sp.，sp.为该属的某个种)、大肠杆菌(Escherichia coli)、链球菌(Streptococcus sp.)、溶糊精琥珀酸弧菌(Succinivibrio dextrinosolvens)、埃氏巨球形菌、光岗菌(Mitsuokella sp.)、解脂厌氧弧菌(Anaerovibrio lipolytica)及发酵氨基酸球菌等［4］，并分离获得了若干株能够特异性地代谢氨基酸的细菌［10］。这些小肠氨基酸代谢菌可以分泌多种蛋白酶和肽酶。研究表明，反刍普雷沃氏菌(Prevotella ruminicola)、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)、埃氏巨球形菌、Mitsuokella multiacidas、反刍月形单胞菌及牛链球菌(Streptococcus bovis)等细菌能够分泌高活性的二肽基肽酶(dipeptidyl peptidase)及二肽酶(dipeptidase)，这可能与单胃动物消化道中的蛋白质消化与吸收有关。氨基酸代谢关键菌的发现能够为靶向肠道细菌，通过营养干预减少氨基酸的发酵，促进宿主的氨基酸利用提供参考。目前，小肠氨基酸代谢菌的研究还很缺乏，通过体外培养结合分子生物学技术分离鉴定潜在的氨基酸代谢关键细菌，这可能对研究单胃动物肠道氨基酸代谢具有重要价值。

3 小肠细菌对氨基酸代谢的去路

蛋白质被宿主和细菌来源的酶分解成小肽和氨基酸后，经氨基酸转运载体进入细菌胞内。研究发现，钠依赖转运和协助扩散是氨基酸代谢菌内主要的氨基酸转运系统［11］。氨基酸的转运还受胞内pH影响，pH在6.0～7.0时氨基酸的转运达到最大，而在pH大于7.0时急剧降低［12］。这些研究表明氨基酸的转运模式受到细菌胞外环境的影响。

细菌内的氨基酸可能还来源于细菌的合成。Torrallardona等［13］给小鼠肠内注射15N标记的氯化铵(15NH4Cl)，结果在血液中发现了15N-赖氨酸。由于哺乳动物并不能通过转氨基作用合成赖氨酸，小鼠体内的15N-赖氨酸只可能来自于肠道细菌的合成。进一步研究证实，细菌产生的赖氨酸中，大约75%是在小肠被吸收的［14］。此外，细菌还可以通过水解尿素后合成氨基酸供机体利用。有研究表明，给人提供15N标记的尿素后，在血液中检测到了15N-苏氨酸［14］。这有可能是细菌水解尿素后合成了苏氨酸供宿主利用。最新研究发现，人肠道细菌组的核心功能基因中含有苏氨酸合成基因［15］，这也在一定程度上证实了肠道上皮与细菌之间氨基酸的交换是双向的［9］。作为代谢途径之一，相当部分的饲粮氨基酸在首过肠道代谢中被肠细胞所降解。Dai等［4］通过对肠道食糜细菌的继代培养发现，猪小肠细菌可快速并大量利用赖氨酸、苏氨酸、精氨酸和谷氨酸。然而，这些被细菌利用的氨基酸的代谢去路并不清楚。有研究表明，用于小肠菌体蛋白合成的缬氨酸有90%来自于饲粮与宿主，新合成的可能只占少部分。这说明细菌从头合成的氨基酸对菌体蛋白的贡献可能并不大。

目前对于氨基酸在小肠细菌中的代谢去路以及可能参与的代谢途径的研究还很缺乏。Dai等［16］利用同位素标记技术测定了在体外条件下，不同氨基酸在不同肠段的小肠细菌中的代谢去路，结果发现回肠肠腔细菌降解脯氨酸和亮氨酸产生CO2的量很少，细菌对赖氨酸、苏氨酸和精氨酸的脱羧代谢只占相对氨基酸净利用的10%，而赖氨酸脱羧代谢占小肠混合细菌对赖氨酸净利用的15%。然而，在蛋白质合成方面，用于合成菌体蛋白的氨基酸占相应氨基酸净利用比例较高的有亮氨酸(50%～70%)、苏氨酸、脯氨酸和蛋氨酸(25%)、赖氨酸和精氨酸(15%)以及谷氨酰胺(10%)。结合猪小肠细菌对氨基酸净利用的数据，约50%以上被细菌利用的氨基酸既没被氧化产生CO2，也没有用来合成菌体蛋白，而是进入了其他代谢途径，这可能包括脱氨基、转氨基、发酵成短链脂肪酸以及斯提柯兰氏反应［4，14］。

4 小肠细菌对氨基酸代谢的区室化(compartmentalization)

由于消化道不同部位的细菌组成存在差异，细菌对氨基酸的代谢可能也是区室化的。Dai等［4］的研究表明，猪小肠不同肠段的细菌对氨基酸的代谢存在差异，十二指肠细菌对氨基酸的利用明显低于空肠和回肠。细菌体外培养12 h后，空肠细菌对赖氨酸的利用显著高于回肠细菌。然而，回肠细菌对精氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和亮氨酸的利用显著高于空肠细菌。我们近期的研究进一步表明，回肠细菌对苏氨酸、组氨酸和支链氨基酸的利用高于空肠细菌［5］。空肠回肠细菌对谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸和精氨酸的利用并无显著差异。然而，肠道细菌的区室化不仅仅体现在不同肠段上，还可能存在于不同肠道层面上。Berg［17］将肠道细菌分为4层，肠腔(lumen)、黏液层(mucus layer)、黏液下层(deep layer of mucus)和肠上皮层(surfaces of epithelial)。而Van Den Abbeele等［18］将黏液层与黏液下层统称为为黏膜层，故将肠道细菌分为3层，肠腔细菌、黏膜细菌和肠壁细菌。不同层次的细菌对氨基酸的代谢也存在差异。我们利用体外发酵技术研究肠壁松散连接细菌和肠壁紧密连接细菌对氨基酸的代谢，结果表明肠壁紧密连接细菌对氨基酸主要表现出较强的合成能力，而肠壁松散连接细菌对氨基酸既存在合成也存在利用［5］。空肠肠壁紧密连接细菌在体外发酵的前12 h均表现为对氨基酸的合成，合成率最高可达40%，而回肠肠壁紧密连接细菌对氨基酸的合成作用主要集中在前6 h，合成率在0～20%。对于肠壁松散连接细菌，除了蛋氨酸、赖氨酸，空肠组在培养前12 h表现出较强的合成能力，在12～24 h以分解为主，24 h以后，除了谷氨酰胺、赖氨酸、谷氨酸和蛋氨酸，其余氨基酸均表现出净合成。这些结果表明小肠细菌对氨基酸代谢的区室化不仅存在于不同肠段，还表现在小肠的不同层面上。小肠细菌对氨基酸的区室化代谢可能是由于肠壁与肠腔中可利用的底物不同造成［19］，不同的细菌组成也是造成氨基酸代谢区室化的重要原因［5］。

5 小肠细菌代谢氨基酸的产物对宿主的影响

小肠是氨基酸吸收的主要部位，而大肠对氨基酸的吸收有限，因此传统营养学往往认为小肠细菌对氨基酸的利用可能是一种营养上的浪费。然而，作为人和动物的另一个“器官”，小肠细菌对氨基酸以及其他含氮化合物的代谢对宿主十分重要。

作为小肠内蛋白质的水解产物，多肽和氨基酸具有广泛的生物学效应。有研究发现，肠道细菌能够代谢蛋白质产生宿主细胞不能产生的肽类物质，如精氨酰谷氨酰胺和丙氨酰丙氨酸［20］。新生小鼠饲粮中补充精氨酰谷氨酰胺能够调节高氧暴露引起的脑损伤，该二肽补充能够抑制乳酸脱氢酶的过度活化并减少促炎症细胞因子白介素6的表达［21］。但是，细菌代谢产生的二肽类活性物质还有待更深入研究。

多胺是肠道细菌代谢氨基酸的脱羧产物，包括腐胺、亚精胺和精胺。腐胺主要由鸟氨酸经鸟氨酸脱羧酶的脱羧作用生成，再经亚精胺合成酶和精胺合成酶的作用生成亚精胺和精胺。这些酶主要由肠道细菌所分泌。尽管目前对于小肠多胺生成的研究较少，但Dai等［16］的研究发现进入细菌的精氨酸，约有70%既不被氧化又不用于合成蛋白质，提示这些氨基酸有可能被脱羧形成多胺。多胺对肠道健康有重要的作用。腐胺具有促进细胞分裂分化，促进RNA、蛋白质等大分子物质合成以及促进炎症修复的作用［22］。Peulen 等［23］给大鼠连续3 d口腔灌服精胺，发现精胺可以提高小肠绒毛高度、降低隐窝深度，增加肠道黏膜重量。Peulen等［24］还发现，灌注亚精胺或精胺能显著降低断奶应激反应，表现为肠道长度、重量及蔗糖酶、乳糖酶不受断奶影响，亚精胺和精胺还能显著提高断奶后肠道酸性细胞数量。多胺带正电荷，可以与RNA、DNA、核酸、蛋白质及其他带负电荷的分子结合从而参与细胞内的各种反应。通过这些互作，多胺能调控细胞的基因表达、信号转导、离子通道功能、DNA及蛋白质合成以及凋亡。因此，多胺对于细菌及肠细胞的增殖、分化及功能至关重要［22］。

小肠中的含氮物质除了来自于饲粮蛋白质，还来自于分泌到肠腔中的含氮化合物，如消化酶、胆汁、黏液、细胞脱落物及尿素。这些含氮化合物可在小肠中进一步被消化与发酵［25］。而细菌可利用这些蛋白质、氨基酸及尿素降解产生的氨合成菌体蛋白［26］，并供机体利用。本实验室最新研究［5］也发现，肠壁紧密连接细菌偏爱利用氨合成氨基酸;同时，研究表明，尿素可以通过血液循环至肠道，肠道表面定植着尿素降解菌，可以将尿素分解成氨［25］。这提示细菌参与了尿素的重新利用，这种尿素分解再合成氨基酸被认为是一种对氮的再循环，其对饲喂低蛋白质饲粮的动物可能在营养上是重要的。

6 小结

肠道细胞和肠道细菌间的代谢互作广泛存在，肠道细菌能够代谢蛋白质和氨基酸，调节肠上皮细胞的代谢稳态。小肠细菌还可以利用其他含氮物质合成氨基酸和菌体蛋白供宿主利用。小肠细菌通过调控氨基酸合成与分解，影响宿主的营养物质供应以及代谢健康。由于肠道内细菌种类众多，分离并鉴定小肠氨基酸关键代谢菌还存在一定的困难。综上所述，肠道细菌参与并调节氨基酸的吸收和利用，因此揭示小肠细菌在小肠蛋白质和氨基酸代谢过程中的作用，有助于理解肠道细菌在宿主营养和健康的重要影响。

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