水生蔬菜真菌病害识别与病原菌鉴定的实用方法

魏林，梁志怀，张屹，肖姬玲，吕刚，3

（1.湖南省植物保护研究所，长沙，410125；2.湖南省西瓜甜瓜研究所；3.中南大学研究生院隆平分院）

1 水生蔬菜真菌病害症状观察和发病程度调查方法

1.1 症状观察

在田间对目标水生蔬菜真菌病害进行症状观察时，都遵循方中达先生所述的先片后点的原则。即先观察病害在全田发生的普遍性和严重度，病害发生的中心区及在田间发展分布，发生时期以及植株受害部位；然后观察病害对整个植株的为害情况，包括是否出现腐烂、萎蔫、萎缩、畸形及生长习性的改变等；最后观察出现典型症状的部位。

在针对由真菌所引起的水生蔬菜的叶斑病和斑点病等，调查时除观察病斑形状、大小、颜色、受害部分正反面（如叶面及叶背）症状、病斑上是否出现霉状物或小黑点或轮纹等孢子和子实体病征外，还需留意症状初始状态，及至发病后期的症状。本文采用的方法是发现初始症状后，定点固定几片叶，挂上标签。随后的一段时期，定时定点观察病害在叶片上症状发展情况，这样做既确定了该病害发生后期的为害症状，又获得了该病害的发生发展规律。

1.2 发病程度调查的分级标准、病原菌致病性等级及品种抗性等级的划分

在水生蔬菜叶部病害发生程度调查、室内人工接种病原菌测定其致病性和寄主抗病性，以及对水生蔬菜各真菌性叶斑病等病害进行田间药剂防治试验时，都需要一个病害调查的分级标准。根据各病害的发生特点，制定了相应的田间叶部病害调查分级标准，室内菌丝块人工接种时藕块发病调查分级标准，以及莲藕腐败病实生苗人工接种发病调查分级标准。实际应用表明，所制定的分级标准可以很好的区分植株的受害程度，进而鉴定出病原菌菌株间致病性的差异及寄主间抗病性的差异。具体的分级标准如下。

①发病程度调查的分级标准 在田间进行莲藕叶部病害发生程度及田间药效防治试验时，制定的调查叶片发病程度分级标准为：0 级:叶片无病斑；1 级：病斑面积占整片叶面积的10%以下；3 级：病斑面积占整片叶面积的11%～25%；5 级：病斑面积占整片叶面积的26%～50%；7 级：病斑面积占整片叶面积的51%～75%；9 级：病斑面积占整片叶面积的75%以上。

②病原菌致病性等级划分 在接种新鲜藕块依据发病藕块的病情程度来判断莲藕腐败病菌和不同菌株的致病力强弱时，制定的调查藕块发病程度分级标准为：0 级：藕块生长正常、完好；1 级：藕块表面有轻微病变，病变尚未侵及藕块体内组织；2 级：藕块组织有明显病变，维管束呈褐色；3 级：藕块维管束呈深褐色，病变部分占藕块总面积的10%以下；4 级：藕块维管束呈深褐色，病变部分占藕块总面积的10%～30%；5 级：藕块维管束呈深褐色，病变部分占藕块总面积的30%以上，每个藕块为一计量单位。依据调查分级的结果，计算病情指数：病情指数=∑（各级藕块数×相对级数值）/（调查总藕块数×5）×100；再依据病情指数，按如下等级划分腐败病病原菌致病力的强弱：病情指数＞70，表示强致病力；30≤病情指数≤70，表示中致病力；病情指数＜30，表示弱致病力；病情指数为0，表示无致病力。

③品种抗性等级划分 在进行莲藕腐败病实生苗人工接种测定品种抗病性时，制定的调查叶片发病程度分级标准为：0 级：植株叶片未见任何发病症状；1 级：叶片仅叶缘出现零星病斑，病斑面积不超过叶该叶片总面积的5%；2 级： 病斑沿叶缘连片，并向叶片中心发展，病斑面积占该叶片总面积的5%～20%；3 级：病斑面积占该叶片总面积的21%～40%；4 级：病斑面积占该叶片总面积的41%～60%；5 级：病斑面积占该叶片总面积的61%～80%；6 级：病斑面积占该叶片总面积的81%～100%，叶片褐腐死亡。莲不同品种对腐败病的抗性评价根据病情指数分成6 个等级：高抗≤10；10＜抗病≤20；20＜中抗≤40；40＜中感≤60；60＜感病≤80；80＜高感≤100。

2 病原菌菌丝体和子实体直接镜检的方法

由病原真菌引起的水生蔬菜病害，在其发病部位会有明显的病征，可以利用这一点，在田间应用放大镜、 室内应用显微镜在分离病原物前进行检查，观察植株发病部位附着的真菌菌丝体和其他营养体的形态和结构、孢子形态和着生方式、子实体形态结构和产生部位等，从而对病原物先有初步的了解。在此过程中，常用的方法有3 种。

①当植株发病部位出现明显的黑点（孢子体）、菌丝体、菌核等病征时，最简单的方法就是接种针直接挑取这些特征物，放在加有一滴无菌水的载玻片上，盖上盖玻片后即可在显微镜下观察。

②当植株发病部位出现的是如黑粉、白粉和其他霉状物时，则可以用小片透明胶带，贴在这些真菌体的部位，然后将沾有真菌的胶带放在载玻片上，于显微镜下观察。

③对于由链格孢或子囊菌等引起的病征十分明显的病害，还可以用尖细的镊子撕取透明的小块受害部位寄主组织，直接放在载玻片上于显微镜下观察。

3 病害病原菌单孢纯化培养方法

莲藕、茭白等水生蔬菜真菌病害的病原菌，在普通的PDA 培养基上的产孢能力均较强。利用这一特点，可以应用简易的稀释涂板挑单孢，对目标菌株进行纯化。具体操作是：将病组织分离获得微生物，在PDA 培养基上培养至大量产孢，在无菌条件下，挑取0.5 cm×0.5 cm 的菌丝块，放置装有1 mL无菌水的离心管中，摇动片刻后，再吸取100 μL 转至下一离心管中，然后用稀释到适宜浓度的离心管中的孢子悬浮液进行PDA 平板涂布，可获得分离度很好的单孢菌落群。

4 用科赫氏法则验证病原菌的方法

4.1 病原菌鉴定的回接方法

对病原菌进行确定时，遵循科赫氏法则，需进行回接验证。回接时的接种方法，因病原菌侵染的部位不同也有所不同。在对莲藕腐败病病原菌进行研究时，筛选强致病性菌株时，选取的是新鲜藕块接种方法：经过分离纯化和分子鉴定的供试镰刀菌菌株用PDA 培养基培养5～6 d，取嫩藕节6～8 cm长的中间段，纵剖切取获得用于接种的藕块；用直径为5～7 mm 无菌打孔器自菌落的边缘打取菌饼，菌饼置于藕块的中央，菌丝体面朝下，每个藕块均匀接种2 个镰刀菌菌饼，然后将装有接种藕块的发芽盒放置于24～26℃恒温培养箱中进行保湿培养；然后按照1.2 的分级标准进行调查和分级确定。

在筛选莲抗腐败病品种研究时，除选用筛选出的强致病性菌株接种菌株外，采用的实生苗蘸根接种，即将破口的莲籽浸在灭菌水中，24～26℃条件下催芽，每天换水1 次。待莲籽萌发长出直立的幼叶、生根3～5 条时，接种莲腐败病病原菌。莲腐败病病原菌在超净工作台上按以下操作进行接种：将每条根在距根尖0.5 cm 处剪断，以造成根系的微伤口，然后将整个根系浸入由无菌水调节的含105～106个孢子/mL 莲腐败病病原菌悬浮液中20～40 min。将接种后的实生苗移栽于盆钵中栽培，接种至少20 d后，按照1.2 中所列病害评价等级对叶片进行病害等级鉴定，鉴定后计算病情指数，确定籽莲品种对腐败病的抗病性类型。

对于各种叶部病害的接种，比较了孢子悬浮液接种和菌丝块接种2 种方法后，采用的是菌丝块接种：先将待接种的健康幼嫩、无任何斑点和褪绿症状的盆栽莲藕叶片接种部位用无菌水擦拭干净，然后将分离纯化的病菌菌丝块以针刺法接种于该部位，并用蘸水的无菌脱脂棉保湿，一般24 h 后接种部位就可出现不同的表型。

4.2 病原菌再分离方法的简化

当应用原始菌株接种植物发病后，对发病组织进行致病菌再分离时，因接种发病的病原菌很单一，所以可将发病的小片组织表面消毒后，在无菌条件下制取植株汁液，稀释适宜倍数后进行PDA平板涂布，然后挑取单孢菌落。

5 病原菌保存的方法

PDA 2～3 月即需转管一次。矿物油覆盖保存，虽然保存的菌种存活期较长，通常2～3 a 才需检查其存活状态，但该种保存效果与操作技术密切相关，同时当活化菌种用接种针从矿物油下挑取的菌丝体，因其携带有矿物油，所以生长较慢，一般要再移植1～2 次才能得到良好的菌种。 所用的方法是用2 mL 的小离心管，挑取在PDA 培养基上培养至产孢0.5 cm×0.5 cm 的2～3 块菌丝块置于其中，加无菌水浸没菌丝块并高出菌丝块0.5 cm，然后将离心管放置于4℃左右的冰箱中，使用时只需在无菌条件下，用接种针挑出置于灭菌的滤纸上吸去多余的水分后置于PDA 培养基上活化培养即可。本实验室用此方法保存的菌株，6 个月以上仍具有很高的活性。