奶牛乳腺炎治疗研究进展

寇明明，刘玉辉，刘　婧，赖金伦，胡长敏，2＊，陈颖钰，2，郭爱珍，2，3（.华中农业大学动物医学院，湖北武汉430070；2.华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，湖北武汉430070；3.华中农业大学国家肉牛产业技术体系疾病控制功能研究室，湖北武汉430070）



奶牛乳腺炎治疗研究进展

寇明明1，刘玉辉1，刘婧1，赖金伦1，胡长敏1，2＊，陈颖钰1，2，郭爱珍1，2，3
（1.华中农业大学动物医学院，湖北武汉430070；2.华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，湖北武汉430070；3.华中农业大学国家肉牛产业技术体系疾病控制功能研究室，湖北武汉430070）

摘 要：奶牛乳腺炎导致奶牛产奶量下降，奶品质降低，甚至奶牛的早期淘汰，对奶牛业造成巨大危害。传统抗生素治疗乳腺炎花费大，治疗效果不确定，且易导致细菌耐药及抗生素残留问题。乳腺炎防治新制剂乳酸链球菌素、Aegis溶菌酶、溶葡萄球菌酶，分别针对病原菌细胞膜、骨架、生物膜而发挥治疗作用；CpGDNA有助于激活机体天然免疫系统；血小板浓缩液不仅具有抗菌作用且可促进乳腺组织修复。在乳腺炎治疗新策略方面，应用激素可调控乳腺细胞分泌及修复能力；另外，调控乳腺细胞相关信号通路及中性粒细胞可控制乳腺炎症反应，达到预防和治疗乳腺炎的目的。

关键词：奶牛；乳腺炎；治疗

乳腺炎（mastitis）是奶牛最常见的生产性疾病，给奶牛业造成了巨大的经济损失［1］。奶牛乳腺炎分临床型和隐性乳腺炎两种，临床型乳腺炎以乳房红肿热痛、乳腺组织损伤为主要特征［2］，而隐性乳腺炎虽无可见临床症状，但在大部分牛场存在，危害更大。奶牛罹患乳腺炎后，引起乳腺上皮细胞合成和分泌功能不同程度障碍，乳脂肪、乳蛋白和乳糖等主要乳成分合成量明显减少［3］，造成牛奶品质显著下降。研究证实，综合评估各种因素造成的损失，奶产量及奶品质下降造成的损失占总损失的49%［1］。国内常见的奶牛乳腺炎治疗方法是使用抗生素，但由于乳腺炎病原菌种类多，乳腺感染致病机制复杂，其治疗效果不理想。长时间大剂量使用抗生素极易导致耐药菌株增多、乳中抗生素残留等问题，严重威胁乳品及生命安全。因此，开发能快速修复乳腺组织，恢复产奶量、提高奶品质的治疗方法迫在眉睫。研究表明，乳酸链球菌素、Aegis溶菌酶、溶葡萄球菌酶、CpG-DNA、血小板浓缩液新型乳腺炎治疗制剂可用于奶牛乳腺炎临床治疗。另外，激素、调控乳腺细胞信号通路及嗜中性粒细胞数量等新型治疗策略也为快速高效防治乳腺炎提供了良好前景。

1　治疗乳腺炎的新制剂

1.1乳酸链球菌素

乳酸链球菌素（Nisin）又称乳球菌肽或乳链菌肽，是从乳酸链球菌发酵物中提取的一种多肽抗菌类物质，已被证明是一种安全天然生物性食品防腐剂和抗菌剂［4］。Nisin最先作为牛乳房乳头的一种消毒剂使用，具有良好的杀菌作用且无潜在组织损伤。Nisin作为乳腺炎治疗药物的主要作用机理是其吸附于细胞膜上以后，破坏细胞膜的完整性，引起细胞裂解及细胞内蛋白大量外泄，致病原菌死亡［5］。另外的研究也证实，Nisin在肺炎链球菌感染小鼠模型的治疗中，也起到良好的杀菌作用。从临床型奶牛乳腺炎分离出金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和无乳链球菌的药敏试验结果可见，Nisin能够有效抑制这两种细菌的生长和繁殖［4］。曹立亭等［6］使用Nisin乳腺灌注治疗临床型乳腺炎，测定治疗前后牛奶中乳脂肪含量、非脂乳固体含量、牛奶蛋白质含量、奶牛泌乳性能等指标，治疗后奶牛所产牛乳的上述指标均显著提高，提示使用Nisin可促进乳腺上皮细胞合成乳成分的能力增强及乳腺组织修复。Szweda P等［7］分离出37株牛乳腺炎源耐药菌株，药敏结果显示其中21株S.aureus对Nisin敏感，进一步证明Nisin具有良好的杀菌作用。

1.2Aegis溶菌酶

Aegis溶菌酶是一种有效的抗菌剂，能切断肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的βl，4糖苷键，破坏肽聚糖支架，在内部渗透压的作用下致细胞胀裂，引起细菌裂解［8］。通过对比溶菌酶和头孢唑啉钠治疗临床型乳腺炎的治疗效果试验，溶菌酶组给药24h后乳清中丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量显著降低，揭示溶菌酶能抑制和清除炎症时产生的氧自由基，从而减少对乳腺细胞的损伤［9］。进一步研究证实，鸡蛋清溶菌酶、鸭蛋清溶菌酶、10%溶菌酶制剂、细菌性溶菌酶对引起奶牛乳腺炎的葡萄球菌均有抑制作用［10］，细菌性溶菌酶治疗效果最好，最有希望用来治疗细菌性乳房炎。沈诚等［11］将人溶菌酶重组质粒pcDNAKLYZ乳腺灌注治疗隐性乳腺炎奶牛，比较灌注前后牛乳中的细菌阴性率，灌注前阴性率为0，灌注后阴性率为51.92%，显示重组质粒抑菌效果显著，该重组质粒对奶牛隐性乳腺炎具有较好的治疗效果。

1.3溶葡萄球菌酶

溶葡萄球菌酶（lysostaphin）是一种从模仿葡萄球菌（S.simulans）中分离获得的含Zn2+内切肽酶，因能有效的清除金黄色葡萄球菌生物被膜而达到杀菌作用［12］。Aguinaga A等［13］使用溶葡萄球菌酶和不同抗生素单独和联合使用对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant S.aureus，MRSA）和甲氧西林敏感菌（methicillin-susceptible S.aureus，MSSA）的研究报告中显示，溶葡球菌酶跟抗生素联合使用比单独使用抗生素，具有较强的杀菌作用并且致MSSA及MRSA菌株的抗生素使用浓度分别降低了2倍～11倍和2倍～14倍。在另一研究中，用MRSA建立小鼠肺炎模型，分别应用不同剂量的溶葡萄球菌酶、万古霉素和PBS进行感染后治疗，结果显示溶葡萄球菌组具有低病死率、肺组织损伤减少、感染部位细菌数较少特征，并成剂量依赖性［14］。Szweda P等［7］研究同时也指出耐药菌对溶葡球菌酶的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）为0.008μg/mL～0.5μg/mL，远远小于MIC最大值32μg/mL，且所有耐药菌对溶葡萄球菌酶敏感。蒋司嘉等［15］使用低、中、高重组溶葡球菌酶粉治疗85头患乳房炎奶牛的104个乳区，试验结果表明低中高剂量重组溶葡萄球菌酶均能有效清除感染乳区的链球菌、葡萄球菌、化脓隐秘杆菌等革兰阳性菌，大幅降低牛奶中的白细胞数，提高日产奶量。不同剂量的重组溶葡萄球菌酶治疗隐性乳房炎、临床型乳房炎的有效率和治愈率都优于青霉素，治疗效果跟剂量呈正相关。

1.4CpG-DNA

CpG-DNA是一些具有免疫激活功能的以未甲基化的CpG基序为核心的DNA序列，它包括含CpG基序的人工合成的CpG-ODN和自然界中低等生物的基因组DNA［16］。在由大肠埃希菌建立的山羊乳腺炎模型中，试验组乳腺组织中大肠埃希菌数显著低于对照组，CpG-ODN对大肠埃希菌诱导山羊乳腺炎的乳腺有保护作用［17］。在分别由金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌诱导的大鼠乳腺炎中，使用CpG-DNA的试验组乳腺组织白细胞介素-6（interleukine-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-ɑ（tumor necrosis factor-ɑ，TNF-ɑ）和CpG-DNA特异性受体TLR-9（Toll-like receptor-9）mRNA表达水平较对照组显著提高，同时减轻炎症反应和炎症介质对组织的损伤，提示CpG-DNA具有乳腺保护作用，其作用机理可能为CpG-DNA与宿主体内天然免疫细胞上的模式识别受体相结合，引起相应的免疫应答［18］。

1.5血小板浓缩液

血小板最常见的作用是在血管损伤部位聚集，形成凝血酶原和纤维蛋白原组成凝血表面从而达到止血作用［19］。Pinto J M等［20］通过使用血小板浓缩液治疗一例人慢性皮肤溃疡，观察到肉芽组织增生，提示治疗有效，可能原因是血小板作为生长因子的载体刺激胶原蛋白产生、活化成纤维细胞和诱导细胞外基质重塑达到修复组织损伤作用。Lange-Consiglio A等［21］使用血小板浓缩液灌注感染乳腺，通过感染乳腺乳汁体细胞数和细菌数评估治疗效果，结果显示使用血小板浓缩液能显著降低牛乳中体细胞数和细菌数，血小板浓缩液在促进炎症消散、减少乳腺实质损伤、降低乳腺炎复发率方面有较好作用。进一步研究证实血小板浓缩液不仅对乳腺组织有修复作用，对奶牛乳腺炎病原菌也有抑制作用。Bielecki T M等［22］采用Kirby-Baue纸片扩散法，观察到人富含血小板的血浆的琼脂平板可以显著抑制金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌的生长。Marian E等［23］从事的另一项研究不仅验证了上述研究结果，而且显示血小板浓缩液对铜绿假单胞菌也有抑制作用。一项乳腺炎流行病学调查的研究显示，金黄色葡萄球菌乳腺炎发病率为16.3%，大肠埃希菌乳腺炎发病率引起的为25.2%［24］，因此有望使用血小板浓缩液治疗由条件致病菌引起的乳腺炎。

2　乳腺炎治疗新策略研究进展

2.1激素调控乳腺细胞的分泌及修复

激素在生殖生理方面应用广泛，乳腺的生长发育和分泌功能均在大脑皮层和丘脑下部的调节下进行，多种内分泌激素发挥着重要作用［25-26］。佟慧丽等［27］建立正常培养的奶山羊乳腺上皮细胞系，用催乳素处理体外培养乳腺上皮细胞，测定催乳素处理组乳腺上皮细胞乳糖和总蛋白水平，显示催乳素诱导乳腺上皮细胞乳糖及乳蛋白分泌水平明显升高。陈建晖等［28］使用催乳素和孕酮处理奶牛乳腺上皮细胞系，测定处理后细胞中的酪蛋白和乳糖含量，显示催乳素处理组升高趋势显著，提示催乳素可以提高乳腺干细胞的数量。激素已被证实有助于提高乳腺细胞分泌能力，提高牛乳品质，促进乳腺组织恢复，但应用方法及其作用机制有待进一步研究。

2.2调控乳腺细胞凋亡及相关信号通路的研究

研究证实乳腺炎的发生发展与乳腺细胞的凋亡及信号通路关系密切，肖阳［29］使用TUNNEL方法检测奶牛不同发育时期乳腺组织的细胞凋亡，证实泌乳晚期凋亡信号最强。乳腺细胞的分化、更新及凋亡与信号通路的调控联系紧密，与此相关的信号通路包括Wnt信号通路、Notch信号通路、Hedgehog信号通路［26］。Wnt信号通路中，β-catenin可以启动Wnt靶基因的表达；抑制β-catenin信号，乳腺细胞分化和增殖被抑制，Notch信号通路的激活能够促进乳腺细胞的自我更新，而Notch的过量表达会抑制细胞的分化。研究表明不同形式的TP63激活Hedgehog信号通路可促进乳腺细胞的有丝分裂［30］。张雯［31］使用脂多糖（LPS）诱导的原代小鼠乳腺上皮细胞炎症模型，检测LPS刺激下细胞因子和炎性介质的分泌以及常见的两条炎症信号转导通路NF-κB和MAPK的变化，结果显示LPS刺激下，乳腺上皮细胞TRL4、NF-κB和下游细胞因子表达升高，显著抑制了p38、JNK和ERK、MAPKs磷酸化。分析各信号通路在乳腺细胞分化更新及凋亡中的机制，精细调控乳腺细胞凋亡也有望成为治疗乳腺炎的新方向。

2.3调控乳腺组织嗜中性粒细胞数量的研究

金黄色葡萄球菌（S.aureus）等致病菌侵入奶牛乳腺后，中性粒细胞向感染乳腺组织集中，发挥吞噬功能清除病原，充当保护机体的第一道防线［32］。然而，如果PMN在炎症灶过度激活或延迟清除，大量PMN可以通过释放氧自由基等有害内容物加重炎症反应，使炎症迁延、慢性化或扩散至全身［33］。因此适时适度清除PMN对于控制乳腺炎症的发展和转归至关重要。Wang Y等［34］使用650nm，2.5 mW，30mW/cm2低强度激光疗法作用LPS诱导的大鼠乳腺炎模型，经低强度激光疗法后，抑制PMN向乳腺腺泡聚集，降低髓过氧化物酶活性，从而减轻乳腺炎症反应。另一项研究证实，日粮中硒含量与乳腺中PMN数量直接相关，LPS诱导的小鼠乳腺炎的病理学切片显示，缺硒小鼠乳腺出现较多PMN浸润、乳腺中组织中促炎因子表达水平高于正常硒含量组小鼠，因此有望通过调控日粮中硒含量，调节乳腺中PMN数量，进而防治奶牛乳腺炎［32］。

综上所述，乳腺炎是一种严重危害奶牛业的疾病，抗生素治疗乳腺炎由于其天然局限性，治疗效果并不理想。乳腺炎防治新制剂乳酸链球菌素、Aegis溶菌酶、溶葡萄球菌酶、CpG-DNA、血小板浓缩液有望替代传统治疗药物；激素疗法、调控信号通路及PMN数量有望作为预防治疗乳腺炎的新策略。积极开展牛乳腺炎治疗新制剂及新策略的研究，为高效防控奶牛乳腺炎提供良好条件。

参考文献：

［1］ Sinha M K，Thombare N N，Mondal B.Subclinical mastitis in dairy animals：incidence，economics，and predisposing factors ［J］.Sci World J，2014：523984.doi：10.1155/2014/523984.

［2］ 宋亚攀，杨利国.中国奶牛乳腺炎防治研究进展［J］.中国奶牛，2010（12）：48-54.

［3］ 张 勇，杨永新，赵兴绪.临床型奶牛乳腺炎乳腺组织的比较蛋白质组研究［J］.中国农业科学，2009，42（4）：1442-1446.

［4］ 王 芳，曹立亭，胡松华.Nisin对奶牛乳腺炎主要致病菌的体外抗菌作用研究［J］.中国兽药杂志，2006，40（10）：12-16.

［5］ 吕淑霞，白泽朴，代 义，等.乳酸链球菌素（Nisin）抑菌作用及其抑菌机理的研究［J］.中国酿造，2008（9）：87-91.

［6］ 曹立亭，胡松华.奶牛临床型乳腺炎Nisin抗菌肽治疗后日产奶量及主要乳成分的变化［J］.中国兽医学报，2010，30（12）：1686-1688.

［7］ Szweda P，Schielmann M，Frankowska A，et al.Antibiotic resistance in Staphylococcus aureus strains isolated from cows with mastitis in Eastern Poland and analysis of susceptibility of resistant strains to alternative nonantibiotic agents：lysostaphin，nisin and polymyxin B［J］.J Vet Med Sci，2014，76（3）：355-362.

［8］ 李 鹤，马 力，王维香.溶菌酶的研究现状［J］.食品研究与开发，2008，29（1）：182-185.

［9］ 张振国，秦晓庆，侯振中.Aegis溶菌酶对临床型奶牛乳腺炎的治疗［J］.中国兽医杂志，2010（2）：40-42.

［10］ 杨 睿，黄 伟，付利芝，等.4种不同来源溶菌酶对引起奶牛乳腺炎葡萄球菌的抑制作用［J］.中国奶牛，2009（7）：30-33.

［11］ 沈 诚，林 源，叶承荣，等.重组溶菌酶质粒pcDNAKLYZ治疗泌乳期奶牛乳腺炎［J］.中国奶牛，2011（4）：4-6.

［12］ 白 宁，杨信怡，游雪甫.重组溶葡萄球菌酶对金黄色葡萄球菌生物被膜的体外清除作用［J］.中国药物与临床，2008，8 （7）：515-518.

［13］ Aguinaga A，Francés M L，Del Pozo J L，et al.Lysostaphin and clarithromycin：apromising combination for the eradication of Staphylococcus aureus biofilms［J］.Int J Antimicrob Agent，2011，37（6）：585-587.

［14］ Chen C，Fan H，Huang Y，et al.Recombinant lysostaphin protects mice from methicillin-resistant Staphylococcus aureus pneumonia［J］.Biomed Res Int，2014：602185.doi：10.1155/2014/602185.

［15］ 蒋司嘉，张继恩，吴聪明，等.重组溶葡萄球菌酶对奶牛乳房炎的疗效研究［J］.中国兽药杂志，2011，45（12）：23-28.

［16］ 范 媛，谢光武，黎晓敏.免疫佐剂CpG-DNA的研究进展［J］.中国动物保健，2009（10）：44-49.

［17］ Zhu Y M，Miao J F，Zhang Y S，et al.CpG-ODN enhances mammary gland defense during mastitis induced by Escherichia coli infection in goats［J］.Vet Immunol Immunopathol，2007，120（3）：168-176.

［18］ Zhu Y M，Miao J F，Fan H J，et al.Protective effect of CpGDNA against mastitis induced by Escherichia coli infection in a rat model［J］.Vet J，2008，175（3）：369-378.

［19］ Anitua E，Andia I，Ardanza B，et al.Autologous platelets as a source of proteins for healing and tissue regeneration［J］. Thromb Haemost，2004，91（1）：4-15.

［20］ Pinto J M，Pizani N S，Kang H C，et al.Application of platelet-rich plasma in the treatment of chronic skin ulce-Case report［J］.An Bras Dermatol，2014，89（4）：638-640.

［21］ Lange-Consiglio A，Spelta C，Garlappi R，et al.Intramammary administration of platelet concentrate as an unconventional therapy in bovine mastitis：First clinical application ［J］.J Dairy Sci，2014，97（10）：6223-6230.

［22］ Bielecki T M，Gazdzik T S，Arendt J，et al.Antibacterial effect of autologous platelet gel enriched with growth factors and other active substances an in vitro study［J］.J Bone Joint Surg Br，2007，89（3）：417-420.

［23］ Mariani E，Filardo G，Canella V，et al.Platelet-rich plasma affects bacterial growth in vitro［J］.Cytotherapy，2014，16 （9）：1294-1304.

［24］ Katsande S，Matope G，Ndengu M，et al.Prevalence of mastitis in dairy cows from small holder farms in Zimbabwe［J］. Onderstepoort J Vet Res，2013，80（1）：523.

［25］ Choudhary R K.Mammary stem cells：expansion and animal productivity［J］.J Anim Sci Biotechnol，2014，5（36）：1-8.

［26］ 李吉霞.牛乳腺上皮细胞永生化及其多功能性研究［D］.陕西杨凌：西北农林科技大学，2010.

［27］ 佟慧丽，高学军，李庆章，等.胰岛素、催乳素对奶山羊乳腺上皮细胞泌乳功能的影响［J］.畜牧兽医学报，2008，39（6）：721-725.

［28］ 陈建晖，佟慧丽，李庆章，等.胰岛素、催乳素和孕酮对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的影响［J］.中国奶牛，2008（8）：9-13.

［29］ 肖 阳.奶牛乳腺上皮细胞凋亡周期性规律及机理［D］.黑龙江哈尔滨：东北农业大学，2012.

［30］ Li N，Singh S，Cherukuri P，et al.Reciprocal intraepithelial interactions between TP63and hedgehog signaling regulate quiescence and activation of progenitor elaboration by mammary stem cells［J］.Stem Cell，2008，26（5）：1253-1264.

［31］ 张 雯.硒对奶牛乳腺炎抗炎作用和炎症信号转导通路调节机制的研究［D］.吉林长春：吉林大学，2014.

［32］ Kumar V，Sharma A.Neutrophils：Cinderella of innate immune system［J］.Int Immunopharmacol，2010，10：1325-1334.

［33］ Tomasinsig L，De Conti G，Skerlavaj B，et al.Broad-spectrum activity against bacterial mastitis pathogens and activation of mammary epithelial cells support a protective role of neutrophil cathelicidins in bovine mastitis［J］.Infect Immun，2010，78：1781-1788.

［34］ Wang Y，He X，Hao D，et al.Low-level laser therapy attenuates LPS-induced rats mastitis by inhibiting polymorphonuclear neutrophil［J］.J Vet Med Sci，2014，22：1-27.

Progress on Treatment of Dairy Cow Mastitis

KOU Ming-ming1，LIU Yu-hui1，LIU Jing1，LAI Jin-lun1，HU Chang-min1，2，CHEN Ying-yu1，2，GUO Ai-zhen1，2，3
（1.College of Veterinary Medicine，Huazhong Agricultural University，Wuhan，Hubei，430070，China；
2.State Key Laboratory of Agricultural Microbiology，Huazhong Agricultural University，Wuhan，Hubei，430070，China；3.Disease Control Laboratory of National Beef Cattle Industry Technology System，Huazhong
Agricultural University，Wuhan，Hubei，430070，China）

Abstract：Dairy cow mastitis causes great harm to the dairy industry including decreased milk yield and milk quality，even the early elimination of dairy cows.The traditional treatment costs is great and uncertain，which is easy to cause bacterial resistance and antibiotic residues.The new preparations including Nisin，Aegis lysozyme and lysostaphin are targeting for cell membrane，skeleton，biofilms of the pathgens，respectively.CpG-DNA induces the host′s nature immune response.Platelet concentration liquid not only produces antibacterial effects，but also promotes tissue repair.It is a scientific and efficient way to prevent mastitis of dairy cows by regulating signal pathway and the amount of PMN.

Key words：dairy cow；mastitis；treatment

作者简介：寇明明（1988-），女，河南许昌人，硕士研究生，主要从事临床兽医学研究。＊通讯作者

基金项目：国家自然科学基金项目（31101874）；公益性行业（农业）科研专项（201003060）

收稿日期：2014-09-14

中图分类号：S857.26

文献标识码：A

文章编号：1007-5038（2015）06-0126-04