鸡NK细胞相关C型凝集素样编码基因研究进展

吴少莲，韩凌霞（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物与比较医学团队兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150001）



鸡NK细胞相关C型凝集素样编码基因研究进展

吴少莲，韩凌霞＊
（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物与比较医学团队兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150001）

摘 要：鸡的C型凝集素样基因编码包括鸡自然杀伤（natural killer，NK）细胞受体在内的许多免疫分子。鸡C型凝集素样编码基因分别位于自然杀伤基因复合体（NK gene complex，NKC）和主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）区域，在NKC区为CD69和CD94/NKG2，在MHC区为相邻的B-NK和B-Lec基因。B-NK是目前唯一已证明表达于NK细胞上的凝集素样受体，其配体尚不清楚，但是已经证明B-NK能够和活化的细胞上的配体结合。论文主要讨论CD69、CD94/NKG、B-NK和BLec 4个基因的系统发育比较和蛋白质结构的研究进展。

关键词：鸡；NK细胞；C型凝集素样受体

大多数C型凝集素样位于细胞膜表面，作为细胞表面黏附受体、信号受体和吞噬受体，通过识别糖链、蛋白质和脂类等多种配体，参与细胞间的黏附、识别以及抗原物质的吞噬清除和细胞内信号转导等功能，在维持机体自身稳态等生理功能以及在感染、炎症和肿瘤免疫等疾病过程中发挥重要作用［1］。

C型凝集素样是一类可以和糖类可逆结合的蛋白质，不具有酶活性，也没有抗体功能，最初鉴定为钙依赖型糖蛋白，包含一个保守的糖类识别结构域（carbohydrate recognition domain，CRD）。还有一些蛋白质具有CRD，但这些结构域序列缺乏钙结合的关键残基，不能和糖类结合，被命名为C型凝集素样结构域（C-type lectin like domain，CTLD）。C型凝集素样是一个大的蛋白质超家族，根据CRD（或CTLD）的位置以及CRD（或CTLD）氨基酸序列的相似程度，C型凝集素样超家族分为7个结构群：蛋白多糖类、肝凝集素、胶原凝集素、选择蛋白、Ⅱ型跨膜蛋白、甘露糖受体和游离的CRD［2］。其中鸡C型凝集素样受体具有Ⅱ型跨膜蛋白特征，根据氨基酸序列特点又可分为4个亚群：亚群1表达于自然杀伤（natural killer，NK）细胞的表面，具有信号传递功能；亚群2代表早期淋巴细胞活化抗原；亚群3在多种白细胞表达；亚群4由多基因家族产生，表达于T细胞和NK细胞，大部分以主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）I类分子为配体［3］。

NK细胞是具有免疫记忆的天然免疫细胞，不表达特异性抗原识别受体，依赖细胞表面多种受体的激活调控，发挥直接杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的功能。Ⅱ型跨膜蛋白C型凝集素样受体是NK细胞的一类重要受体［4-5］。鸡C型凝集素样受体基因分别位于自然杀伤基因复合体（NK gene complex，NKC）和MHC区域，在NKC区为CD69和CD94/NKG2，在MHC区为两个相邻的B-NK和B-Lec基因。

鸡在遗传学和基因组学方面是目前研究最成熟的非哺乳类脊椎动物，在进化系统中其免疫系统具有独特特征。经过长期人工培育，目前国际上已成功培育多个MHC等位基因纯合的近交系鸡品系［6］，已在与多种病毒病、细菌病和寄生虫病的致病性和免疫机制中广泛应用［7］，在免疫学和医学研究中是对以近交系小鼠和大鼠为主要研究对象的重要补充，在抗病遗传学、比较医学研究中具有重要的地位。本文主要对鸡NK细胞相关的C型凝集素样受体的研究进展进行综述，并重点关注不同MHC单倍型鸡NK细胞表面的C型凝集素样受体研究。

1　鸡NKC上的C型凝集素基因结构

通过序列比对和分子建模的方法，在鸡的1号染色体鉴定出一个C型凝集素样基因，与哺乳动物代表一种早期活化抗原的CD69同源；相距70 Mb处，存在另一个C型凝集素样基因，最初被称为鸡CD94/NKG2同源物，因为与哺乳动物的CD94和NKG2都同源。按照哺乳动物的命名，将与人12号染色体、鼠6号染色体共线性的鸡1号染色体区域也称为NKC。哺乳动物的NKC包含多个不同的C型凝集素样受体基因，而在鸡的NKC目前只发现了这两个凝集素基因。与人和小鼠的相比，其基因间构成存在一些染色体重排，因此有可能还存在其他C型凝集素样基因。

鸡CD94/NKG2的CTLD的保守序列与人的CD94核苷酸同源性达62%，与NKG2A同源性为52%。但鸡CD94/NKG2特异性单克隆抗体8G8与鸡的囊细胞和胸腺细胞反应最小，与单核外周细胞和脾几乎所有的凝血细胞反应，与组织中的大部分NK细胞，如胚脾、肺和肠不反应。鸡CD94/ NKG2胞外段有一个半胱氨酸残基，胞质尾区有一个变异的免疫受体酪氨酸激活基序（hemITAM），而hemITAM存在于Dectin-1和C型凝集素样受体CLEC-2（C-type lectin-like receptor-2）中，但是哺乳动物的CD94/NKG2却没有。这些差异表明鸡NKC或许不是编码NK细胞受体的基因，也不是CD94或NKG2同源基因。因此，CD94/NKG2表示为鸡CLEC-2同系物［8］。

2　MHC上C型凝集素样基因结构与组织分布

鸡的MHC结构组成相比其他动物简单，在92 kb区仅有19个基因，在这个区意外发现2个C型凝集素样受体基因，B-NK和B-Lec［9］，因为至今尚未在哺乳动物的MHC发现存在C型凝集素样受体基因［10］。B-NK和B-Lec位置相邻，以相反的方向转录。B-Lec与人的凝集素样转录产物-1基因（lectin-like tanscript 1，LLT1）、鼠的C型凝集素样相关蛋白基因（C-type lectin related，Clr）亲缘关系最近，与LLT1类似，包含一个起内吞作用的基序。在鸡的MHC和Rfp-Y（包含MHC样基因）区还发现了与B-Lec同源较高的其他C型凝集素样基因，如17.5、chYLec-2、Blec3和Blec4［3］。其中Blec3在BLec和B-NK上游，类似B-Lec，其氨基酸序列与哺乳动物的早期活化抗原CD69高度同源，已证明Blec4是假基因［11］。

B-NK是唯一证明表达于鸡NK细胞上的C型凝集素样蛋白。B-NK与人的自然杀伤细胞受体蛋白家族1（natural killer receptor proteins 1，NKRP1）同源性最高，胞质内都具有一个功能性的免疫受体酪氨酸抑制基序（immunoreceptor tyrosinebased inhibitory motif，ITIM）。ITIM中的酪氨酸残基发生磷酸化后，被蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosinphosphtase，PTP）分子上的Src同源结构域（srchomology domain（SH2）结合，招募PTP并使之活化，抑制蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine ki-nase，PTK）参与的激活信号转导通路。不同MHC单倍型鸡的B-NK等位基因具有高度多态性，而其编码区较高的非同义突变/同义突变（non-synonymous versus synonymous，dN/dS）比例导致多个氨基酸的突变。例如B12单倍型鸡的B-NK蛋白特异性单抗仅能检测到B12型鸡NK细胞，与其他单倍型鸡的NK细胞亲和力几乎低于可检测水平［12］。而GenBank公布的B19（acc.No.AM950194.1）和B21（acc.No.AM950195.1）鸡的BNK基因组序列在150nt到640nt的范围内存在13处核苷酸变异，全部导致氨基酸突变，且大多位点位于BNK受体蛋白的胞外区，位置分散［13］。

B-Lec在不同单倍型鸡之间保守性较强，尽管也呈现出个别核甘酸变异，但是多数为同义突变。可能经历了净化选择，因为内含子核苷酸的变异显著高于外显子［14］。有学者认为B-NK的多态性是由病原编码的B-Lec诱骗分子筛选形成，而不是与B-Lec共进化［15］。B-Lec多态性缺失的原因尚不清楚。

B-NK的转录产物（mRNA）在鸡的NK细胞表达，在B细胞、T细胞和巨噬细胞系中不表达，在淋巴组织中大量表达，与NKR-P1在这些细胞的表达情况一致，所以B-NK是目前唯一证明的表达于鸡NK细胞的C型凝集素样蛋白，有可能是鸡NK细胞的受体。早期研究表明经白介素2（interleukin，IL-2）刺激的鸡NK细胞中存在B-NK mRNA，然而，利用特异性单克隆抗体表明在正常细胞的表面也检测到B-NK蛋白，包括来自胚胎脾脏的CD8+T细胞，以及部分成年鸡脾脏的CD8+αβT细胞和部分成年鸡血液中CD8-的γζT细胞［11］。相比之下表达B-LecmRNA的组织分布更广泛，佛波酯（PMA）刺激脾细胞后B-Lec表达量大量上调，与CD69和LLT1的表达相符［9，16-17］。

3　B-NK可能的配体

鸡C型凝集素样受体基因B-NK/B-Lec对与哺乳动物的NKC基因对有相似的序列特点，内含子外显子的组成、基因转录方向、组织分布以及对刺激的应答，尤其是与小鼠NK细胞的非MHC依赖性免疫监测体系受体-配体基因NKrp1/Clr和人的NKR-P1/LLT1，因此有人认为鸡B-NK蛋白的配体是B-Lec［14，18-21］。B-NK的胞外结构域可以和活化脾细胞的一些配体相互作用，似乎能解释B-Lec 是B-NK的配体，因为在活化脾细胞中B-Lec的mRNA表达量上调。但是该结构域不能和转染细胞上标记的MHCⅠ类分子或者B-Lec反应［12］。在B-NK和B-lec转染细胞中，二者可以二硫键连接成Ⅱ型跨膜糖蛋白的二聚体形式表达于细胞表面，尽管B-Lec的表达量不是很高［13］。目前还没有直接证明B-NK和B-Lec存在交互作用，当然不排除由于技术原因、亲和力低，或者B-NK具有高度多态性的原因。

由于B-NK和B-Lec基因在MHC上毗邻，以及C型凝集素样基因的保守性，有人假设MHC祖先有一个主要的第一位点，包含涉及天然免疫应答的受体和配体，这一位点在病原体的选择压力下迅速进化。鸡痘病毒（FPV）基因组包含几个编码C型凝集素样序列的开放阅读框，其中P14372能在感染细胞的表面检测到，暗示可能作为免疫逃逸配体，阻止被NK细胞溶解［22］。系统进化树分析显示，一些鸡痘病毒衍生的C型凝集素样与哺乳动物NK细胞MHCⅠ类受体配体Ly-49同源，由此推断鸟类中有一些同源基因可能被病毒劫持，但C型凝集素样在感染细胞表面如何发挥作用并不清楚。Ly49的同源类似物目前只出现于病毒的开放阅读框，例如鸡痘病毒基因组编码的C型凝集素样蛋白PFV293（P14371）与CD96也具有极高的同源性。鸡免疫球蛋白受体（Ig-like receptors，CHIR）或许取代了这些受体的功能［3］。

关于B-NK的作用机制，有假说提出B-NK蛋白特异性识别不同MHC单倍型鸡优势表达的MHCⅠ类分子（BF2）。但不同单倍型的B-NK基因进化关系（B12/B19/B14-B21-B2/B4/B15）与BF2基因（B12/B19/B4-B21-B14/B15/B19）并不一致。另一种可能是B-NK与劣势表达的MHCⅠ类分子BF1α1结构域α螺旋的某些特定氨基酸相互作用，然而B-NK的等位基因（B12/B19/B14-B21-B2/B4/ B15）与BF1的分子系统发育关系（B12/B19-B14/ B15-B4/B21/B2）也不同，而且该位点的氨基酸被免疫球蛋白样NK细胞受体（Ig-like NK receptors，KIRs）识别，且KIR在哺乳动物中是由淋巴细胞识别复合体（lymphocyte recognition complex，LRC）编码的。尽管鸡的基因组中有许多免疫球蛋白样受体ChIRs，但哺乳动物的免疫球蛋白样、凝集素样NK细胞受体与MHCⅠ类分子的作用位点不同［14］。

4　结语

鸡C型凝集素样家族不仅种类多，而且多与NK细胞、免疫应答相关。我国已选育成功MHC单倍型鸡［23］，深入分析不同单倍型鸡B-NK蛋白的结构及其组成，或许能对阐明鸡NK在遗传抗性和天然免疫机制上提供某些思路。

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Advance in Chicken NK Cell Associated C-type Lectin Like Encoding Genes

WU Shao-lian，HAN Ling-xia
（Unit of Laboratory Animal and Comparative Medicine，Harbin Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology，Harbin，Heilongjiang，150001，China）

Abstract：Chicken C-type lectin genes encode many immunological molecules including potential chicken natural killer cell receptors.Chicken c-type lectin genes of CD69and CD94/NKG2locate in the areas of NK gene complex （NKC），and B-NK and B-Lec locate in the areas of major histocompatibility complex（MHC）.The B-NK is the only conformed c-type letine like receptor expressed on NK cells so far.The ligand of B-NK is confused，but it can combine ligand on activated cells which has been demonstrated.Here，the current knowledge on phylogenetic comparation and protein structures of the four genes were discussed.

Key words：chicken；NK cell；c-typelectin-like receptor

中图分类号：S852.4

文献标识码：A

文章编号：1007-5038（2015）06-0134-04

作者简介：吴少莲（1989-），女，山东蓬莱人，硕士研究生，主要从事禽的免疫遗传学研究。＊通讯作者

基金项目：科技部支撑项目（2013BAK11B02）

收稿日期：2014-11-11