脑脊液肿瘤细胞学检查在视网膜母细胞瘤诊疗中的价值

谢南丽，孙岩峰，王 军，刘红艳，苗丽霞，袁海莲，李彦珊，张向兰，杨新吉，刘秋玲

脑脊液肿瘤细胞学检查在视网膜母细胞瘤诊疗中的价值

谢南丽1，2，孙岩峰2，王 军2，刘红艳2，苗丽霞2，袁海莲2，李彦珊2，张向兰2，杨新吉3，刘秋玲2

目的 探讨脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF)肿瘤细胞学检查在视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)诊疗中的价值。方法 回顾性分析2010-05至2014-06武警总医院儿科经临床确诊且资料完整的RB患者125例的CSF细胞形态学检查(cytomorphology，CM)和免疫流式细胞术(flowcytometry，FC)结果，并与其临床转归进行对比分析，以总结CSF肿瘤细胞学检查在RB患者诊治中的价值。结果 125例视网膜母细胞瘤患者中，治疗前首次CSF中发现肿瘤细胞的是24例。首次CSF检查发现肿瘤细胞的患者比未发现肿瘤细胞的患者平均生存时间明显缩短(6.4个月vs16.0个月，P<0.05)，且病死率明显升高(P<0.05)；治疗前影像学证实转移的患者比仅CSF发现肿瘤细胞的患者平均生存时间明显缩短(3.3个月vs8.6个月，P=0.021)，但病死率差异无统计学意义(100%vs81%，P=0.19)；脑脊液FC比CM检测敏感性好(P<0.001)。结论 RB易发生颅内转移且危及患者生命，CSF的肿瘤细胞学检查是早期发现中枢神经系统转移的重要手段，联合应用CM与FC有效提高CSF中肿瘤细胞的检出率。针对CSF中发现肿瘤细胞的患者，应在全身系统化疗的基础上，增加鞘内化疗以降低这部分患者的病死率，延长生存时间。

视网膜母细胞瘤；脑脊液；肿瘤细胞学检查；诊疗价值

视网膜母细胞瘤 (retinoblastoma，RB)是婴幼儿最常见的眼内恶性肿瘤[1]。中枢神经系统是主要转移部位，一旦发生病死率极高[1,2]。尽早发现肿瘤转移病灶，早期治疗，是延长患者生存期的重要前提。CSF肿瘤细胞学检查是诊断肿瘤中枢神经系统转移的重要手段之一，对中枢神经系统肿瘤的诊断、复发预测，是否进行椎管内化疗及其疗效评估提供客观依据。CSF肿瘤细胞学检查在RB诊疗中的作用，目前国内相关研究较少。本研究总结分析了武警总医院儿科住院的125例经临床确诊且资料完整的RB患者的CM和FC结果，以探讨CSF肿瘤细胞学检查在RB诊治中的价值。

1 对象与方法

1.1 对象 收集2010-05至2014-09经临床确诊且资料完整的125例RB患者资料。其中男72例(58%)，女53例(42%)，男女比例为1.3∶1；单眼75例(60%)，双眼50例(40%)；发病年龄1～94个月，中位年龄19个月。全部患者均经临床表现、眼眶增强CT/MRI、神经烯醇化酶检查临床确诊，行手术治疗的患者进行术后病理诊断。经腰椎穿刺、骨髓穿刺、脊髓或头颅MRI、全身骨扫结果进行分期。分期标准：眼内分期采用IIRC法[3]；术后病理显示，肿瘤已侵犯球外视神经、筛板及视神经断端或CT/MRI等影像学检查肿瘤已侵犯眼球球外视为眼外期；CT/MRI检查、CSF肿瘤细胞学、骨髓细胞学、全身骨扫描检查提示，远处组织或器官受累均视为远处转移期。分期为眼内D期、E期、眼外期、远处转移期的患者以及复发RB患者均视为晚期患者。疾病分期以一只眼纳入统计，双眼发病者以分期较重眼纳入。依据入院后评估，各个患者的分期：A-C期(n=0)，D期(n=42)，E期(n=30)，眼外期(n=29)，远处转移期(n=24)。病例入选标准：(1)经病理诊断或临床诊断明确的初治RB患者；(2)均已结束临床治疗；(3)均按要求进行随访；(4)病历资料完整(包括临床表现、实验室检查、影像学资料)；(5)治疗前同时行脑脊液检查；(6)患者监护人自愿签署腰椎穿刺知情同意书。

1.2 方法 根据分期不同确定治疗方案。所有患者均应用VEC方案化疗(长春新碱1.5 mg/m2,第1 d；依托泊苷150 mg/m2,第1、3 d；卡铂560 mg/m2,第1 d)。眼内期眼内A-C期给予4～6个化疗联合眼动脉化疗；眼内D、E期给予6～8个疗程化疗，化疗后肿瘤无明显变化或视力丧失的眼内期患者，建议进行眼球摘除；眼外期患者全身化疗延长至9～12个疗程，联合眼眶剜除术和(或)眼眶外射疗；远处转移期患者延长全身化疗疗程至12个。

针对晚期患者，全身化疗同时联合椎管内注射化疗药物(鞘内化疗)，每疗程化疗第1天及停药前行腰椎穿刺、鞘内注药、CSF检查(CSF常规、生化、浓缩查肿瘤细胞及免疫流式检查)。鞘内注药的疗程依据分期不同分期全身化疗疗程而定，化疗药物为地塞米松、甲氨蝶呤。具体方案：(1)年龄小于12个月,甲氨蝶呤5 mg，地塞米松2 mg；(2)12～24个月，甲氨蝶呤7.5 mg，地塞米松2 mg；(3)24～36个月，甲氨蝶呤10 mg，地塞米松5 mg；(4)大于36个月，甲氨蝶呤12.5 mg，地塞米松5 mg。

1.3 检查方法

1.3.1 腰椎穿剌 腰椎穿刺前，与家长充分沟通取得同意，并签署腰椎穿刺知情同意书。腰椎穿刺操作方法：通常取弯腰侧卧位，自L2-S1(以L3-4为主)椎间隙穿刺。术者用左手固定穿刺点皮肤，右手持穿刺针以垂直脊柱的方向缓慢刺入，儿童进针为2～4 cm，当针头穿过韧带与硬脑膜时，可感到阻力突然消失，此时将针芯缓慢抽出(严防脑脊液迅速流出，造成脑疝)，即可见脑脊液流出，如无脑脊液流出，轻轻捻动穿刺针柄或稍改变方向及深度即可；如检测颅压可将提前准备好的测压管测量压力，随后收集脑脊液5 ml分别送检CM检查1 ml、FC检查2 ml、CSF常规及生化检测各1 ml。操作完毕后，将针芯重新插入，并一起拔出穿刺针，局部按压1～2 min，覆盖消毒纱布，用胶布固定后安返病房，嘱咐患者去枕平卧4～6 h，避免引起术后低颅压头痛。颅高压患者穿刺前甘露醇降低颅内压再进行穿刺。

1.3.2 脑脊液检查 (1)CM检查：收集新鲜CSF后，2 h以内用自然沉淀法制片，待玻片自然干燥后行瑞式-吉姆萨复合染色法染色，15 min后冲洗，在低倍镜、油镜下逐个的辨认细胞形态并进行显微镜照相；根据细胞形态可发现RB肿瘤细胞(如图1)。(2)FC检查：采用单克隆抗体四色直接免疫荧光素( FITC/PE/ PerCP /APC) 标记法。视网膜母细胞瘤相关的免疫表型是流式细胞术检测脑脊液肿瘤细胞的基础。对进行过单克隆抗体荧光素标记的脑脊液标本，流式细胞术分析细胞免疫表型。所用抗体组合: CD4 FITC/ CD3 PE /CD45 Per CP/ CD19 APC，CD9 FITC/ CD81 PE /CD45 Per CP/ CD56 APC，CD99 FITC/ HLA-ABC PE /CD45 Per CP/ CD56 APC，HLA-DR/FITC CD64 PE /CD45 Per CP / CD14 APC。2 ml新鲜CSF离心沉淀后弃上清液再进行流式细胞仪检测，所有患者均行CD45单克隆抗体标记。将沉淀的细胞分装到3支小试管内，然后将选定的单克隆抗体，各取20 μl加入到试管中，室温避光反应15 min 后，加PBS 至1 ml，上流式细胞仪检测，流式细胞仪型号为FACS Calibur，检测前常规进行质控检测和荧光补偿，选淋巴细胞群为被测细胞(既设门)，每次计数在106以上。当出现CD45-，或以下任何情况时：CD56+/ CD45-/CD81+，CD56+/ CD45-/CD81+/CD9+免疫表型时，判断CSF中发现肿瘤细胞(以上抗体及流式细胞仪均购自Becton Dickinson公司)。

图1 RB脑脊液肿瘤细胞学形态图(W-G，光镜，×40倍)

A.瘤细胞呈大小不等的团块状，瘤细胞胞核不规则、圆形或椭圆形，核染色质较致密粗糙，核仁0～1个，少数细胞间空泡；胞浆染蓝色，融合一片； B.可见单个散在分布的癌细胞，常有胞体增大、胞核增大，形状似原始样细胞，胞质比例失调，胞浆量多，着色深蓝色

1.4 观察指标 统计患者从患病后经我院开始规律治疗到2014年12月为随诊时间。每例患者建立随访档案，治疗终止后第1年每1个月复查1次，连续3次；后每3个月复查1次，连续3次；第2年每6个月复查1次，连续3次，逐步延长复查时间。常规复查项目包括眼眶或头颅CT/MRI、全脊柱MRI检查，对发生中枢神经系统转移患者还需增加CSF常规、生化、浓缩查肿瘤细胞、免疫流式检查。

1.5 CSF检查与临床预后评价 (1) CSF中发现肿瘤细胞患者的发生率、病死率、复发率；(2)首次CSF中发现肿瘤细胞的患者与首次CSF中未发现肿瘤细胞的患者进行对比，观察病死率、生存时间之间的差异，绘制两组患者的生存曲线；(3)首次CSF检查发现肿瘤细胞的患者与治疗过程中复查CSF时发现肿瘤细胞的患者进行对比，观察治疗后复发率、病死率之间的差异；(4)颅脑和或脊髓膜影像学证实转移的患者与无影像学异常仅CSF发现肿瘤细胞的患者比较，观察病死率、生存时间之间的差异，绘制两组患者的生存曲线；(5)比较细胞形态学检查与流式细胞术检查的检灵敏性、特异性，比较两种检查的一致性分析。

1.6 统计学处理 采用SPSS16.0统计学软件进行数据处理。计数资料采用百分率表示。不同组别的复发率、病死率采用χ2检验及Finder确切概率分析比较。采用Kaplan-Meier法进行生存分析，比较不同组别生存差异运用Log-Rank检验，P<0.05表示具有统计学意义。

2 结 果

2.1 临床诊断结果 采用CM对125例初诊RB患者首次CSF标本进行检查，30例(30/125，24%)患者最终证实发生CSF转移。其中24例中枢神经系统转移患者系首次CSF检查时发现肿瘤细胞，另外6例系治疗过程中复查CSF时发现肿瘤细胞。16例(16/24，66.7%)患者治疗前CSF中发现肿瘤细胞但缺乏神经系统症状且脑脊髓影像学无异常。14例(14/30，46.7%)患者同时伴有颅脑和或脑脊膜MRI/CT影像学异常，包括脑脊膜转移9例，颅脑转移5例，6例(6/30，20.0%)患者存在头疼、呕吐等中枢神经系统转移症状。随访时间2～54个月，平均随访13个月。30例中枢神经系统转移患者中27例(27/30，90%)患者死亡，平均生存时间5个月(2～24个月)，3例CSF中发现肿瘤细胞的患者经治疗后无复发或死亡，截至随访结束时分别存活17个月、22个月、24个月。

2.2 首次CSF肿瘤细胞检查与预后 24例首次CSF检查中发现肿瘤细胞的患者中22例(22/24，91.7%)死亡，平均生存时间5个月(2～24个月)，余2例(2/24，8.3%)(无病存活患者，截止至随访结束已存活22个月、24个月。101例首次CSF阴性的患者中有6例(6/101，5.9%)(D、E期各1例，眼外期4例)在2～6个疗程化疗前复查发现CSF发现肿瘤细胞，复查MRI示：脑脊髓膜见异常信号影，其中5例平均生存5.2个月(5～13个月)后死亡，1例病情稳定，存活17个月。首次CSF中发现肿瘤细胞患者病死率91.7%，平均生存时间为6.4个月(2～24个月)，首次CSF中未发现肿瘤细胞的病死率5.0%，平均生存时间16个月(2～54个月)，两组之间生存时间和病死率差异均具有统计学意义(P<0.05，图2)。30例CSF检查发现肿瘤细胞的患者经治疗后21例复查CSF转阴(17例在首次CSF检查发现肿瘤细胞和4例首次CSF未发现肿瘤细胞患者)；余9例治疗2～5个疗程后CSF未消失,均病情进展死亡。2例首次CSF检查发现肿瘤细胞患者和1例治疗过程复查CSF发现肿瘤细胞的患者经治疗后无复发死亡，无病存活，治疗结束后6个月、1年分别复查CSF细胞学检查，均阴性；余18例(18/21，85.7%)在治疗过程中CSF再次发现肿瘤细胞，头颅或脊柱MRI可见颅内或脑脊膜异常信号影，并出现呕吐、抽搐、意识丧失、瘫痪等症状，最终抢救无效死亡。首次CSF中发现肿瘤细胞患者复发率88.2%(15/17)，首次CSF未发现肿瘤细胞但进展转移患者复发率75.0%，差异无统计学意义(P=0.48)。

图2 首次CSF(+/-)患者生存曲线

图3 影像学组与脑脊液组生存曲线

2.3 影像学检查与预后关系 24例首次CSF检查中发现肿瘤细胞患者中有8例在治疗前经影像学检查确诊为中枢系统转移，均复发死亡，其中16例脑脊髓影像学无异常的患者均通过CSF检查证实转移，其中3例无病存活，余13例治疗后死亡。影像学证实转移患者(影像学组)患者病死率100%(8/8)，平均生存时间3.3个月(2～7个月)，脑脊髓影像学无特异仅CSF细胞学查发现肿瘤细胞(CSF组)病死率81.3%(13/16)，平均生存时间为8.6个月(2～24个月)，两组之间生存时间差异具有统计学意义(P=0.021)，两组病死率无统计学差异(P=0.19，图3)。

2.4 流式细胞术与肿瘤细胞学检查的诊断价值 125例中61例的首次脑脊液CM同时进行FC检查，30例在CSF中发现肿瘤细胞，其中FC阳性7例，CM阳性12例，FC与CM同时阳性11例。首次脑脊液细胞形态学检查诊断结果：13例(13/61，21.3%)为阳性，48例(48/61，78.6%)为阴性。13例细胞形态学检查结果阳性病例，其中11例被最终流式细胞学检测结果和临床诊断证实脑脊液转移。8例发生脑脊液转移的患者首次细胞形态学检查未能检测出肿瘤细胞，但在随访观察期间脑脊液细胞形态学检查均发现肿瘤细胞，确诊转移。首次脑脊液流式细胞术检查诊断结果：18例(18/61，29.5%)为阳性，43例(43/61，70.4%)为阴性。18例阳性病例中17例(17/18，94.5%)被临床诊断证实脑脊液转移，仅1例(1/18，5.5%)为假阳性。43例阴性病例中2例被诊断发生中枢系统转移，证实此2例(2/43，5%)为假阴性。19例RB患者最终被确诊脑脊液转移，17例(17/19，89.5%)首次脑脊液流式细胞术检查阳性。52例RB患者CSF标本两项检查结果一致，11例CM与FC均为阳性，41例CM与FC均为阴性；余9例CSF两项检查结果不一致，2例CM阳性但FC阴性，7例FC阳性胞但CM阴性。细胞形态学检查与流式细胞术检查的灵敏性分别为58%和90%，特异性分别为95%和98%，比较两种检查的一致性分析，Kappa值为0.699，P<0.001。

3 讨 论

自1963年Reese和Ellsworth[4]首次倡导所有视网膜母细胞瘤患者发病初期进行腰椎穿刺，评估中枢神经系统情况，以明确疾病分期，指导治疗。但近几年，一些研究机构提出并非所有RB患者都应实施腰椎穿刺及脑脊液检查。首先，腰椎穿刺作为一种有创检查，给家属及患者带来极大精神压力；再者，RB发生CSF转移率为2.0%～4.5%[5]，发生率相对较低；其次，CSF检查结果阳性率仅3.1%[6]。因此，国内外专家建议腰椎穿刺不作为所有RB患者的常规检查，建议针对眼摘后病理高风险的患者进行该项检查[6-8]。

本研究自2010-05以来对所有入院的RB患者进行常规腰椎穿刺及脑脊液检查，脑脊液转移率24%，发达国家脑脊液肿瘤细胞学检查阳性率仅为7%[5]，本组脑脊液转移率明显增高，这与我国作为发展中国家经济医疗条件巨大差异，晚期病例多相关。其他发展中国家发生远处转移，如土耳其Ozdemir等[9]报道，在91例RB患者中，远处转移发生率达20.9%；Gunduz等[10]报道，在192例RB患者中，中枢神经系统转移的发病率达10%。由此可见，发展中国家RB发生中枢神经系统转移并非少见。本研究中，80%的中枢转移患者系首次脑脊液检查发现肿瘤细胞，证实了脑脊液细胞形态学检查可早期诊断脑脊液转移，必须作为我国所有RB患者常规评估项目。

本研究发现，一旦发生中枢神经系统转移，其病死率为90%，首次CSF肿瘤细胞学查发现肿瘤细胞的患者中病死率达91.7%，明显高于首次CSF检查阴性的患者(病死率5%)，证明RB一旦发生中枢神经系统转移致死率极高。目前，对发生中枢神经系统转移后的恶性肿瘤患者多采取姑息治疗，治疗方法包括全身化疗、鞘内注药治疗、局部放放射治疗以及外科脑室-腹腔分流术等。椎管内化疗药物注射已成为中枢神经系统转移的主要治疗方法。但鞘内化疗药物选择性极少，目前RB的鞘注药物及剂量多采用预防、治疗中枢神经系统白血病的方案，使用药物为甲氨蝶呤、地塞米松[11]。文献[12]报道，脑膜转移癌患者，如未经治疗，通常死于进展性脑功能障碍，平均生存期仅为4～6周。本组CSF中发现肿瘤细胞患者，积极开展全身化疗联合鞘内注药，延长治疗疗程，有3例无病存活17个月以上，27例治疗后死亡，平均生存期5个月。研究中，尽管全身化疗基础上联合鞘内注药，延长治疗疗程，生存时间明显延长，复发率、病死率降低，但患者复发率(88.2%)、停药后病死率(85.7%)未明显改善。由于且全脑、全脊髓放疗治疗易导致骨髓抑制、诱发第二肿瘤风险，外照射治疗不作为治疗RB的首选，但目前仍是RB化疗失败后挽救治疗的重要手段，可采用调强放疗技术或质子放疗获得更好靶区适形，进一步减少正常组织的照射剂量，颅内神经病变症状的患者进行累计区域放疗。为了进一步提高这部分中枢转移患者生存率，是否对CSF中发现肿瘤细胞的患者早期进行局部或全脊柱外放疗仍值得商榷。

本研究发现，66.7%的患者治疗前无影像学异常，仅CSF发现肿瘤细胞者存活率达18.7%，平均生存期延长至8.6个月，生存率及生存期明显高于影像学证实转移患者。研究显示，由于肿瘤细胞主要沿神经或血管浸润，在转移过程中并不一定形成实质性肿块，影像学难以早期诊断中枢神经系统转移。CSF肿瘤细胞学检查对缺乏中枢神经系统症状以及颅脑及脑脊膜影像学改变的早期转移患者提供客观诊断依据，早期进行干预治疗，提高存活率，延长生存时间。CSF细胞学检查可作为早期诊断中枢神经系统转移的重要手段，中枢神经系统发生影像学改变提示已处于转移终末期，提示预后不佳。

尽管细胞形态学检查具有经济、快捷、操作简易等优点，可临床广泛推广，但由于受标本收集、涂片等多步骤及主观因素的限制，CSF肿瘤细胞学检查可能造成对中枢神经系统转移诊断的延误。随着免疫学、分子生物学不断改进，近来文献报道，采用免疫流式细胞学检查对CSF标本进行检测，对于中枢神经系统转移早期诊断发挥重要作用[13，14]。笔者采用流式细胞术联合细胞形态学检查，对61例初治RB患者脑脊液进行分析，以评价流式细胞术作为脑脊液转移诊断和预后判断的临床意义，结果表明，流式细胞术对脑脊液转移诊断的灵敏性为90%，细胞形态学检查对脑脊液转移诊断的敏感性仅为58%。Shen等[15]对103例儿童浆膜腔积液进行分析，证实流式细胞术比细胞形态学对积液的肿瘤诊断灵敏，两者敏感性分别为87.8%和61%。与我们的研究结果相近。CSF检查过程中联合免疫流式细胞学，可提高CSF检查的准确性。

RB易早期发生中枢神经系统转移，病死率极高，入院患者应常规开展CSF细胞学检查。联合应用CM与FC可有效提高CSF中肿瘤细胞的检出率。针对CSF中发现肿瘤细胞的患者，应在全身系统化疗的基础上，增加鞘内化疗以降低这部分患者的病死率、复发率，延长生存时间。但对这部分患者的病死率仍未有明显改善，是否对早期进行局部或全脊柱外放疗仍值得商榷。

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(2015-02-15收稿 2015-05-20修回)

(责任编辑 郭 青)

Value of cerebrospinal fluid cytology examination in diagnosis and treatment of children retinoblastoma

XIE Nanli1，2, SUN Yanfeng2,WANG Jun2, LIU Hongyan2, MIAO Lixia2, YUAN Hailian2, LI Yanshan2, ZHANG Xianglan2, YANG Xinji3, and LIU Qiuling2.

1.Graduate Division, Liaoning Medical University, Jinzhou 121001，China；2. Department of Pediatrics, 3. Department of Orbital Disease Research Institute, the General Hospital of the Chinese People’s Armed Police Forces, Beijing 100039, China

Objective To study the application value of cerebrospinal fluid (CSF) cytology examination in diagnosis and treatment of retinoblastoma. Methods We reviewed the results of CSF cytology examination by cytomorphology (CM) and flow cytometry (FC) for detecting early metastasis of retinoblastoma (RB) during July 2011 to July 2014. 125 cases of CSF cytology examination and prognosis were retrospectively analyzed. Results 125 CSF samples from 125 newly diagnosed RB patients were detected by CM before treatment,24 patients had a positive first sample by initial cytology examination. Patients with positive CSF samples by cytology examination tended to a poorer prognosis than patients with negative first sample. At the time of diagnosis, patients with imaging change of nervous system metastasis tended to a poor survival than patients with positive cytology only at initial samples, mean survival time (3.3 monthsvs8.6 months,P=0.021); mortality rate (100%vs81%,P=0.19). FC retained significantly more sensitivity than that of CM (sensitivity 90%vs58%，P<0.01).Conclusions Diagnosis of RB involving CSF with application of CM and FC can improve the detection rate.Havenmore intensive chemotherapy (including system and intrathecal chemotherapy) immediately after diagnosis might be beneficial for timely treating and it also prolonged these patients’ survival.

retinoblastoma; cerebrospinal fluid;cytology examination;diagnosis and treatment

首都临床特色应用研究项目(Z121107001012055)

谢南丽，硕士研究生，E-mail：18618201968@163.com

1.121001 锦州，辽宁医学院研究生院；100039 北京，武警总医院：2.儿科，3.眼眶病研究所

刘秋玲，E-mail:wj670@vip.sina.com

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