虎刺提取物对CCl4致肝损伤的保护作用

王 丹，马瑞丽，张 蓉，苏兆亮，汤 建*，欧阳臻

(江苏大学 1.药学院； 2.基础医学与医学技术学院，江苏 镇江 212013)

虎刺提取物对CCl4致肝损伤的保护作用

王 丹1，马瑞丽1，张 蓉1，苏兆亮2，汤 建1*，欧阳臻1

(江苏大学 1.药学院； 2.基础医学与医学技术学院，江苏 镇江 212013)

目的：研究虎刺提取物对CCl4致小鼠急性肝损伤的保护作用及与所含蒽醌类化合物之间的量效关系。方法：小鼠分为模型组，正常组，阳性药组(联苯双酯)，石油醚部位组、乙酸乙酯部位组、水部位组和75%乙醇提取物组。正常组小鼠每日灌胃(ig)生理盐水10 mL·kg-1，阳性对照组联苯双酯200 mg·kg-1，药物组按300 mg·kg-1(高剂量组)、150 mg·kg-1(低剂量组)剂量给药。连续给药6天后小鼠按剂量10 mL·kg-1腹腔注射(ip)0.1 % CCl4花生油溶液，心脏取血，测血清谷丙转氨酶(ALT)，谷草转氨酶(AST)活性，并取肝脏做组织切片观察其病理学形态变化。采用高效液相(HPLC)法初步分析，采用醋酸-甲醇显色法测定各样品中总蒽醌的含量。结果：与模型组相比，虎刺水部位(300 mg·kg-1) 能明显降低小鼠血清中ALT、AST的含量(p<0.01)，水部位(150 mg·kg-1) 和75%乙醇提取物(300 mg·kg-1) 也能降低ALT、AST的含量(p<0.05)。病理切片发现水部位和总提物能明显减轻肝组织病理学症状。结论：虎刺提取物具有明显的肝保护作用，其中水部位活性最强，保护活性可能与蒽醌化合物有关。

虎刺；CCl4致肝损伤；总蒽醌；HPLC

虎刺 (Damnacanthusindicus)，又名绣花针，小黄连，分布于长江流域及以南地区，中医上主要用于治疗肝炎、风湿痹痛、黄疸水肿等病症[1-2]，同时也是瑶药中具有代表性的药材之一，用于治疗肝炎、身体虚弱及小儿疳积等[3]。该植物中报道较多的是以大黄素为代表的蒽醌类化合物[4-7]。

本实验研究虎刺75%乙醇提取物以及三种萃取部位的保肝活性，以及各部位中总蒽醌化合物的含量，以期发现虎刺中蒽醌类化合物含量与保肝活性的关系，对虎刺的开发提供参考。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

虎刺药材于2009年9月购于亳州药材市场(产地 湖南)，经江苏大学药学院欧阳臻教授鉴定为茜草科虎刺属植物Damnacanthusindicus(Linn.) Gaertn. f.。芦丁标准品和大黄素标准品(中国药品生物制品鉴定所)；联苯双酯(国药集团)；清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；CCl4(分析纯)；甲醇(色谱纯)和双蒸水。

1.2 仪器与设备

UV-2102PCS型紫外-可见分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司； LC-20A高效液相色谱仪，日本岛津；精密电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；LOOYE ZX98-1旋转蒸发仪，上海鲁伊工贸有限公司；酶标仪，MolecuLar Device公司。

2 方 法

2.1 样品的制备

200 g虎刺药材粉碎至10～20目，加至75%乙醇1 000 mL中，回流提取2 h×3，提取液合并、浓缩至无醇味 (约200 mL)，取其中20 mL浓缩液蒸除溶剂，得到3.0 g浸膏。其余部分分别用150 mL×3石油醚、乙酸乙酯萃取，蒸除溶剂后得石油醚部位0.3 g，乙酸乙酯部位2.6 g。剩余水部位上HP20大孔吸附树脂，3 BV水洗除去无机盐、黏液和寡糖等杂质，再用3 BV 90%乙醇洗脱，收集该部位，蒸除溶剂、冻干得粉末4.0 g。样品冷藏于-20℃冰箱中备用。

2.2 保肝活性测试

参照文献[8-9]，88只ICR小鼠(20±2)g，雌雄各半，随机分成 11组，每组8只，分别为模型组，正常对照组，联苯双酯组，石油醚部位高、低剂量组，乙酸乙酯部位高、低剂量组，水部位高、低剂量组和总提物高、低剂量组，ig给药。模型组和正常对照组小鼠每日生理盐水10 mL·kg-1，阳性对照组每日联苯双酯200 mg·kg-1，其它药物组按300 mg·kg-1(高剂量组)、150 mg·kg-1(低剂量组)剂量给药。每日一次，连续6天。于末次给药或生理盐水后4 h，除正常组小鼠ip生理盐水10 mL·kg-1外，其余六组小鼠分别ip 0.1 % CCl4花生油溶液10 mL·kg-1(0.2 mL/只)。禁食，自由饮水，18 h 后心脏取血，3500 r/min 离心10 min，取上清液，参照试剂盒说明书操作，于450 nm下测定ALT，AST指标。同时做肝脏病理组织学检测，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察肝脏病理组织学改变。

2.3 总蒽醌含量测定

参照文献[10]制备标准品大黄素的标准曲线：A=51.184C-0.0013 (R2=0.9999)，浓度0.1～2.0 μg·mL-1范围内线性良好。供试液(1 mg/mL, 甲醇)各1 mL于10 mL容量瓶中，加0.5% 醋酸镁-甲醇溶液至刻度，摇匀。同时，以0.5%醋酸镁-甲醇溶液为空白对照，在511 nm处测定吸光度，计算即得总蒽醌的含量。

2.4 样品的HPLC分析

GraceSmart RP 18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温：25 ℃，流动相A：双蒸水，流动相B：色谱甲醇，梯度洗脱 (0 min，25% B；25 min，60% B；35 min，100% B；45 min，100% B)，流速： 0.8 mL·min-1，检测波长：270 nm，进样量 20 μL。样品 25 mg溶于25 mL容量瓶中，进样前 0.45 μm滤膜过滤。

2.5 统计学处理

3 结 果

3.1 对血清ALT、AST活性的影响

如表1所示，虎刺水部位高剂量组(300 mg·kg-1)小鼠血清中ALT和AST值分别为(66.16±9.83)U·L-1和(35.21±5.15)U·L-1，显著低于模型组小鼠血清中ALT、AST值(p<0.01)，接近阳性对照药。水部位低剂量组(150 mg·kg-1)小鼠血清中ALT和AST值分别为(71.14±8.21)U·L-1和(38.91±3.51)U·L-1，与模型组相比具有显著差异(p<0.05)，抑制作用接近75% 乙醇提取物高剂量组(300 mg·kg-1)。

表1 虎刺提取物对小鼠血清ALT、AST的影响

注：与模型组比较*p<0.05，**p<0.01。

数据表明，虎刺水部位对CCl4所致小鼠急性肝损伤有较好的保护作用。75% 乙醇提取物对CCl4所致小鼠急性肝损伤也显现出一定的保护作用。虎刺乙酸乙酯部位抑制小鼠血清中ALT、AST作用较弱，低剂量组(150 mg·kg-1)的ALT、AST值接近于模型组。而石油醚部位能明显的升高小鼠血清中ALT、AST值，较模型组还高，说明石油醚部位可能对肝脏有损伤作用。

3.2 组织病理学检查

正常组小鼠肝小叶完整，肝索排列规则未见炎性细胞，肝细胞结构形态正常，细胞排列整齐，大小均匀，分界清楚，细胞核大而圆，核质分布均匀，核仁清晰。模型组肝小叶结构破坏，肝索结构排列紊乱，肝窦明显扩张，血管附近有明显炎症细胞浸润，肝细胞肿胀，胞质疏松，呈气球样变性，表现为以中央静脉为中心的局灶性肝细胞变性、坏死。而阳性药物组较模型组肝窦扩张及炎性细胞的浸润不明显，肝细胞的胞质均匀，气球样变性不常见。同时，水部位组肝小叶结构基本完整，肝组织排列较整齐，肿胀、变性坏死程度明显减轻，坏死灶区明显减少；乙酸乙脂部位组(300 mg·kg-1)较模型组症状减轻，但仍可观察到疏松胞质，气球样病变的肝细胞。表明水部位和乙酸乙酯部位对CCl4致肝损伤小鼠具有保护作用，而水部位组药效强于乙酸乙酯部位。需注意的是，石油醚部位(300 mg·kg-1)与模型组相比，小叶内坏死广泛，仍然严重，无明显减轻，说明石油醚部位组无保肝作用。150 mg·kg-1给药组小鼠组织切片在病理学变化不明显(图片未列出)。

图1 肝脏组织病理切片 (HE,×100)

3.3 各部位蒽醌成分的含量

四种样品的总蒽醌含量见表2，剩余水部位中总蒽醌含量最高，为7.67 mg·g-1(相对于萃取物，下同)，75%乙醇提取物和乙酸乙酯部位中总蒽醌含量较低，分别为3.68 mg·g-1和3.25 mg·g-1。石油醚部位游离蒽醌的含量为6.69 mg·g-1。

表2 不同部位总蒽醌的含量

3.4 样品的HPLC分析

四种样品的HPLC图见图2。可知，石油醚、乙酸乙酯和剩余水部位中，化合物分离和富集的效果较好，从HPLC图可以看出，这三个部位重合的程度较低，并且较好的保留了75%乙醇提取物中的化学成分。

图2 四种样品高效液相色谱图

4 讨 论

本课题研究了虎刺75% 乙醇提取物以及石油醚、乙酸乙酯和剩余水部位的保肝活性以及与所含总蒽醌的量效关系。结果表明：水部位具有良好的保肝作用，能够显著的降低血清中ALT和AST的水平，而石油醚部位升高血清中ALT和AST的水平。由此可见，虎刺中的保肝活性成分主要集中在水部位。同时发现，75%乙醇提取物、乙酸乙酯部位和剩余水部位的保肝活性与所含的总蒽醌呈正相关。但石油醚部位虽然含有较多的游离蒽醌，却升高血清中ALT和AST的水平，表明石油醚部位可能含有损伤肝脏的物质，这为虎刺的合理使用提供了依据。后续的工作中将对虎刺的剩余水部位做进一步研究，确证保肝活性成分。同时研究石油醚部位，发现可能损伤肝脏的物质基础。

[1] 国家中医药管理局《中华本草》编委会. 中华本草：第6册[M]. 上海: 上海科学技术出版社, 1999: 413-414.

[2] 晁志，张宏伟. 虎刺的本草考证[J]. 中药材, 2003, 26 (10): 762-764.

[3] 覃迅云，罗金裕，高志刚. 中国瑶药学[M]. 北京: 民族出版社,2002: 851-852.

[4] 江苏新医学院. 中药大辞典[M]. 上海: 上海人民出版社, 1977: 1331.

[5] 杨燕军，舒惠一，闵知大. 巴戟天和恩施巴戟的蒽醌化合物[J]. 药学学报, 1992, 27 (5): 358-364.

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[7] LEE S W, KUO S C, CHEN Z T, et al. Novel anthraquinones fromDamnacanthusindicus[J]. J Nat Prod, 1994, 57 (9): 1313-1315.

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Protective Effect from Different Extracts ofDamnacanthusindicusagainst CCl4-induced Liver Injury in Mice

Wang Dan1, Ma Ruili1, Zhang Rong1, Su Zhaoliang2, Tang Jian1*, Ouyang Zhen1

(1.School of Pharmacy； 2.School of Medical Science and Laboratory Medicine, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

Aim：To study the protective effect from different extracts ofDamnacanindicusagainst CCl4-induced acute liver injury in mice, as well as the relationship with the contents of total anthraquinones. Methods：Mice were divided into 11 groups. Mice in model and normal groups were administrated (ig) with saline at 10 mL·kg-1daily. Mice in positive group were administrated (ig) bifendate, 200 mg·kg-1. Tested groups were administrated (ig) at 300 mg·kg-1(high dose group) and 150 mg·kg-1(low dose group), respectively. After consecutive 6 days, the mice were administrated (ip) with CCl4solution in peanut oil at 10 mL·kg-1. The aspartate aminotransferase (ALT), alanine aminotransferase (AST) levels in cardiac blood serum were tested. The liver biopsy morphology was evaluated. Each sample was analyzed for determining the content of total anthraquinones and chemical profile. Results：Water-soluble fraction (300 mg·kg-1) could significantly deduced ALT, AST levels (p<0.01). Water-soluble fraction (150 mg·kg-1) and 75% ethanol extract (300 mg·kg-1) could lower ALT, AST levels to some degree (p<0.05). Water-soluble fraction and 75% ethanol extract could significantly reduce areas of necrosis of liver tissue. Conclusion：The water-soluble fraction had remarkable protective effects on liver injury, which could be associated with the contents of total anthraquinones.

Damnacanthusindicus; liver injury; total anthraquinones; HPLC

2015-05-12

江苏省镇江市社会发展项目(SH2014062)；博士后基金(2012M521023)。

王丹，女，硕士研究生， 主要从事中药化学成分及药理活性研究。

*通讯作者：汤建，男，博士，副教授。E-mail：jt.u@hotmail.com

10.3969/j.issn.1006-9690.2015.06.006

R285

A

1006-9690(2015)06-0020-04