香榧假种皮提取物的体外抗氧化活性研究

何宛燕，陈雨欣，于勇杰，倪 穗

(宁波大学 海洋学院，浙江 宁波 315211)

香榧假种皮提取物的体外抗氧化活性研究

何宛燕，陈雨欣，于勇杰，倪 穗*

(宁波大学 海洋学院，浙江 宁波 315211)

测定了香榧假种皮提取物中的总酚含量，并采用DPPH自由基清除法、β-胡萝卜素漂白法、硫代巴比妥酸法等3种方法评价了香榧假种皮提取物的体外抗氧化活性。结果表明：香榧假种皮提取物中总酚含量为(76.67±2.06)mg/g。香榧假种皮提取物具有一定的抗氧化活性，且在一定浓度范围内呈剂量效应关系，但是其抗氧化活性低于BHT和抗坏血酸。DPPH自由基清除法、硫代巴比妥法、β-胡萝卜素漂白法等3种方法测定香榧假种皮提取物体外抗氧化活性的IC50值分别为1.55 mg/mL、2.02 mg/mL 、0.58 mg/mL。

香榧假种皮；提取物；自由基；抗氧化

自由基是人体代谢过程中产生的中间产物，人体正常的生命活动需要适量的自由基存在和参与[1]。但是机体内过量的自由基积累能够引起DNA链断裂、细胞蛋白羰基化、脂质过氧化反应，从而引起机体衰老、癌症等疾病的发生[2-3]。此外，食品中油脂和含脂食品的酸败也是由自由基反应引起的[4]。因此寻求和开发能够清除自由基的抗氧化剂具有重要的意义。但是化学合成型抗氧化剂如丁基羟基茴香醚(BHA)、2, 6-二叔丁基对甲酚(BHT)等对人体有毒害作用，因此寻找安全、高效的天然抗氧化物质成为近年来研究的热点。

香榧(Torreyagrandiscv. Merrillii)属红豆杉科(Taxaceae)榧属(TorreyaArn.)裸子植物，第三纪孑遗植物，雌雄异株，常绿乔木，在我国浙江、安徽、江苏、福建等省份丘陵地区均有栽培[5-6]。它是我国特有的珍稀干果和优质高产的木本油料树种，具有材用、药用、果用、油用和观赏、绿化等多种用途。香榧的种子香脆可口、营养丰富，含有丰富的矿物质、维生素、蛋白质，种仁含油率为60%左右，其中不饱和脂肪酸含量达80%以上，具有非常高的食用价值[7]。香榧还具有杀虫消积、润肺化痰、滑肠消痔、健脾补气、去瘀生新等功效，《本草纲目》《神农本草经》《中国药典》等著作对其药用价值均有记载[8]。

香榧假种皮是香榧加工过程中的大宗弃物。据报道，香榧假种皮中富含二萜类、挥发油、木质素、黄酮、多酚化合物等活性成分，具有开发成为植物源型抗氧化剂、抑菌剂的潜力[9-10]。查阅资料发现，目前国内对于香榧假种皮的研究主要集中在活性成分提取、化学成分鉴定等方面，而对于香榧假种皮提取物功能特性的研究却较少。笔者曾采用超临界CO2流体萃取香榧假种皮提取物，并采用GC-MS对其提取物成分进行了分析，发现香榧假种皮提取物主要成分是二萜类物质，其次为羧酸、酯类、倍半萜和单萜类物质，但是并未对其功能特性进行研究。本文在此研究基础上，测定了超临界CO2萃取法得到的香榧假种皮提取物中的总酚含量，采用DPPH·自由基清除法、β-胡萝卜素漂白法(β-carotene Bleaching Assay，BCB)、硫代巴比妥酸法(Thiobarbituric Acid Reactive Substance Assay，TBARS)等方法对香榧假种皮提取物的体外抗氧化活性进行评价，以期为香榧假种皮的综合利用和高附加值产品的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1材料与试剂

香榧假种皮：于2013年9月采自浙江宁海榧坑村香榧生产基地树龄20年左右的树上。从成熟的香榧种子上剥离下假种皮，在避光条件下自然阴干、粉碎后过筛，避光密封保存于4 ℃条件下备用。没食子酸：Bio Basic公司；1, 1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)：日本和光纯药株式会社；β-胡萝卜素、亚油酸、2, 6-二叔丁基对甲酚(BHT)、福林酚、L-α-卵磷脂、十二烷基硫酸钠等购于Sigma-Aldrich公司；2, 2偶氮二异丁基脒二盐酸盐(AAPH)、2-硫代巴比妥酸、抗坏血酸、无水乙醇、甲醇等均购于国药集团化学试剂有限公司；以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

SFE-2型超临界CO2萃取仪：美国Applied Separations公司；TU-1810紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；L600台式离心机：湖南湘仪仪器开发有限公司；电子分析天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；HH-S4数显恒温水浴锅：金坛市医疗仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 香榧假种皮提取物的制备

采用超临界CO2萃取法提取香榧假种皮提取物：称取粉碎度40目的香榧假种皮10.0 g于萃取釜中，在静态萃取时间20 min、动态萃取时间2.5 h、萃取温度45 ℃、萃取压力34 MPa的条件下进行萃取，收集萃取物，得率为22.12%±0.09%，4 ℃条件下保存备用。

1.3.2 香榧假种皮提取物中总酚含量测定

标准曲线的建立：以没食子酸为标准品，准确吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL的没食子酸溶液(0.2 mg/mL)于比色管中，加入蒸馏水2 mL，再加入1 mL福林酚试剂，混匀后于黑暗处静置5 min，加入5 mL 15% Na2CO3溶液，用蒸馏水定容至10 mL，充分混匀后避光放置1 h，以零管为空白，测定其在760 nm波长处吸光度，以吸光度为纵坐标，标准品质量为横坐标绘制标准曲线方程。样品含量的测定：取0.1 mL 0.1 mg/mL样品于比色管中，按上述步骤添加试剂，离心后测定其吸光度，通过标准曲线计算香榧假种皮提取物中总酚含量。

1.3.3 香榧假种皮提取物体外抗氧化活性研究1.3.3.1 DPPH自由基清除法

取不同质量浓度的香榧假种皮提取物乙醇溶液2 mL与2 mL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液混合，室温下避光反应30 min后在515 nm测定其吸光度，记为A1。空白样用2 mL无水乙醇代替测试样品，吸光度记为A0。以抗坏血酸和BHT作为阳性对照。每组试验进行3次，结果取平均值。自由基清除率按下式计算：

DPPH·自由基清除率(%)=(A0-A1)/A0×100%

1.3.3.2 β-胡萝卜素漂白法

取0.1 mg β-胡萝卜素溶于10 mL氯仿中，加入20 mg亚油酸和1 g吐温40，然后在45 ℃条件下旋转蒸发除去氯仿，加入50 mL蒸馏水，立即振荡摇匀得到乳化液。取0.2 mL不同浓度的香榧假种皮提取物乙醇溶液与4.8 mL乳化液于试管中混合，50 ℃恒温水浴2 h，测定其在470 nm波长处吸光度。空白用0.2 mL无水乙醇代替测试样品。以抗坏血酸和BHT作为阳性对照。每组试验进行3次，结果取平均值。用抑制率来表示其抗氧化能力。抑制率按下式计算：

抗氧化抑制率(%)=(AA(120)-AC(120))/(AC(0)-AC(120))×100%

式中：AA(120)为t=120 min时样品的吸光度，AC(120)为t=120 min时空白样的吸光度，AC(0)为t=0 min时空白样的吸光度。

1.3.3.3 硫代巴比妥酸法

参照Kulisic等的方法，有改动[11]。取1.1 g十二烷基硫酸钠溶于质量分数为0.8%的硫代巴比妥酸溶液中，得到混合液。分别取0. 1 mL不同浓度的样品甲醇液与0. 5 mL 10 mg/mL的卵磷脂乳浊液混合，加入50 μL 0.07 mol/L的AAPH溶液引发脂质过氧化反应。随后加入1.5 mL质量分数为20%的乙酸溶液和1.5 mL上述混合液，振荡均匀后沸水浴加热1 h，冷却后测定其在532 nm处吸光度值，记为A1。空白样用0.1 mL甲醇代替测试样品，吸光度值记为A0。以抗坏血酸和BHT作为阳性对照。每组试验进行3次，结果取平均值。抗氧化率按下式计算：

抗氧化率(%)=(A0-A1)/A0×100%

2 结果与分析

2.1 香榧假种皮提取物中总酚含量

多酚类化合物是一种重要的植物次生代谢产物。多酚类物质主要有单宁、花色素、酚酸和黄酮类化合物。植物中多酚类化合物具有较强的抗氧化活性，并具有抗衰老、治疗心脑血管疾病、降血脂、抗癌等功效[12]。按1.3.2的方法得到没食子酸的标准曲线，如图1所示。

图1 没食子酸的标准曲线

由图1可以看出，线性回归方程为y=0.012 1x+0.003 9(其中x为没食子酸质量浓度，mg/L，y为760 nm处吸光度值)，相关系数R2=0.999 8。经测定，香榧假种皮提取物中总酚含量为(76.67±2.06)mg/g。

2.2 香榧假种皮提取物体外抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基清除能力

DPPH是一种以氮为中心的稳定自由基，其结构中含有3个苯环，1个氮原子上有1个孤对电子，在乙醇溶液中呈紫色，在515 nm波长处有强吸收值[13]。当体系中有自由基清除剂存在时，DPPH的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度变小，因此可用于检测样品的自由基清除能力。不同浓度的香榧假种皮提取物、BHT和抗坏血酸清除DPPH自由基的能力如图2所示。

图2 香榧假种皮提取物的DPPH自由基清除能力

由图2 可以看出，香榧假种皮提取物具有清除DPPH自由基的能力，且在一定范围内呈明显的剂量效应关系，但是清除能力低于BHT和抗坏血酸。香榧假种皮提取物对DPPH自由基清除率随浓度的增加而增加。当提取物浓度为3 mg/mL时，DPPH自由基清除率为73.78%，但是浓度超过3 mg/mL后对DPPH自由基的清除作用变化很小，在测试浓度范围内(1 mg/mL～5 mg/mL)最大清除率达到80.13%。香榧假种皮提取物清除DPPH自由基的IC50值约为1.55 mg/mL，BHT和抗坏血酸清除清除DPPH自由基的IC50值分别为50.07 μg/mL、6.38 μg/mL。

2.2.2 β-胡萝卜素漂白法

β-胡萝卜素漂白法主要用于评价抗氧化物质在乳化脂质体系中的抗氧化能力。其原理是体系中的亚油酸自动氧化生成的自由基与β-胡萝卜素反应，引起β-胡萝卜素的褪色，当有抗氧化剂存在时，可以减缓β-胡萝卜素漂白速率，减缓程度与样品的抗氧化活性有关[14]。不同浓度的香榧假种皮提取物、BHT和抗坏血酸对β-胡萝卜素漂白速率的抑制效果如图3所示。

图3 β-胡萝卜素漂白法测定香榧假种皮提取物抗氧化率

由图3可知，香榧假种皮提取物能够抑制β-胡萝卜素黄色的衰减，其IC50值约为0.58 mg/mL。在提取物浓度为1 mg/mL时，其对β-胡萝卜素漂白的抑制率为72.40%，在测试浓度范围内(1 mg/mL～5 mg/mL)最高抑制率达到93.01%。阳性对照BHT也表现出极强的抗氧化活性，其IC50值约为19.68 μg/mL。抗坏血酸是公认的一种强抗氧化剂，但是在β-胡萝卜素漂白法实验中却不能抑制β-胡萝卜素黄色的衰减。这是因为抗坏血酸属于水溶性抗氧化剂，在反应体系里主要集中在水相，而脂相中的含量很低，因此没有表现出抗氧化活性。这与前人的报道相符，被称为“极性反常”现象[15]。

2.2.3 硫代巴比妥酸法

硫代巴比妥酸法是评价抗氧化剂抑制脂质过氧化活性的方法之一。体系中的多不饱和脂肪酸和胆固醇等被自由基氧化后会产生丙二醛及其它次级代谢产物，丙二醛等在酸性环境中与硫代巴比妥酸反应形成粉红色络合物，在532 nm波长处有最大吸光度。当体系中有抗氧化剂存在时，能够抑制丙二醛的产生，从而降低其在532 nm波长处吸光度。不同浓度的香榧假种皮提取物、BHT和抗坏血酸的抗氧化活性如图4所示。

图4 硫代巴比妥酸法测定香榧假种皮提取物抗氧化率

由图4可以看出，香榧假种皮提取物和BHT的抗氧化率随其浓度的增加而增加。在该测试中，抗坏血酸没有表现出很强的抗氧化活性。当香榧假种皮提取物浓度为1 mg/mL时，其抗氧化率为41.59%，在测试浓度范围内(1 mg/mL～5 mg/mL)，其抗氧化率最高为63.84%。硫代巴比妥酸法评价香榧假种皮提取物抗氧化率的IC50值约为2.02 mg/mL。BHT和抗坏血酸的IC50值约为0.84 mg/mL，10.01 mg/mL。

3 讨论与结论

3.1 香榧假种皮提取物中的总酚含量

对香榧假种皮提取物中的总酚含量进行测定，结果表明，香榧假种皮提取物中总酚含量为(76.67±2.06)mg/g。多酚类化合物具有较强的抗氧化活性，这是因为其酚羟基结构中的邻位酚羟基很容易被氧化成为醌类物质，对体系中的自由基具有较强的捕捉能力。据报道，多种植物提取物的抗氧化活性均与其多酚类化合物含量密切相关。陈亚琪等对油茶蒲粗提取物及分级萃取各相的抗氧化活性进行了研究，结果表明总酚含量与提取物抗氧化活性呈正相性，总酚含量越高，抗氧化活性越强[16]。Sarikurkcu 等对穗花牡荆果实提取物抗氧化活性进行研究，结果发现多酚含量较高的水提物具有较高的抗氧化活性[17]。此外，研究表明水果[18]、茶叶[19]等植物性食品的抗氧化活性均与其多酚含量有关。

3.2 香榧假种皮提取物的体外抗氧化活性

DPPH自由基清除法、硫代巴比妥酸法和β-胡萝卜素漂白法等体外抗氧化实验表明香榧假种皮提取物具有一定的抗氧化活性，但是抗氧化能力低于同等浓度的BHT和抗坏血酸。DPPH自由基清除法、硫代巴比妥法、β-胡萝卜素漂白法等3种方法测定香榧假种皮提取物抗氧化活性的IC50值分别为1.55 mg/mL、2.02 mg/mL 、0.58 mg/mL。香榧假种皮富含酚类化合物且具有良好的抗氧化活性，这说明香榧假种皮具有开发成为天然抗氧化剂和自由基清除剂的潜力。研究香榧假种皮提取物的体外抗氧化活性，对于香榧假种皮的综合利用和高附加值产品的开发具有重要意义。

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The Antioxidant Activity Evaluation of the Extract fromTorreyagrandiscv. Merrillii Aril

He Wanyan, Chen Yuxin, Yu Yongjie, Ni Sui*

(School of Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

This study is designed to determine the total phenolic and antioxidant activities of the extract fromTorreyagrandiscv. Merrillii Aril. The antioxidant activity of the extract was evaluated by three different test system, the DPPH free radical scavenging method (DPPH), β-carotene bleaching method (BCB) and thiobarbituric acid reactive substance assay (TBARS). It was found that the total phenolics of the extract was (76.67±2.06)mg/g. The extract of theTorreyagrandiscv. Merrillii Aril exhibited antioxidant activity when tested by each method. But the antioxidant activity of the extract was less effective than the butylated hydroxytoluene (BHT) and ascorbic acid of the equal concentration. The concentration of the extract influenced its antioxidant power, and The IC50value of three different method such as DPPH, BCB, TBARS was 1.55 mg/mL, 2.02 mg/mL, 0.58 mg/mL respectively.

Torreyagrandiscv. Merrillii Aril; extract; free radical; antioxidant activity

2015-03-24

宁波市重大(重点)科技计划攻关项目(2012C10015)；宁波市农业科技重大专项(2014C11006)。

何宛燕(1994—)，女。研究方向：食品加工。E-mail:kuankuanhe@163.com

*通讯作者：倪穗(1965—)，女，教授，研究方向：植物生物技术。E-mail:nisui@nbu.edu.cn

10.3969/j.issn.1006-9690.2015.06.001

S573

A

1006-9690(2015)06-0001-04