免疫复合型溃疡性结肠炎大鼠模型的实验研究*

康宜兵，吕永慧，吴宇金，钟志勇，武 昕

(1.广东省广州市中医医院，广东 广州 510000；2.广东省医学实验动物中心，广东 广州 510000)

·实验研究·

免疫复合型溃疡性结肠炎大鼠模型的实验研究*

康宜兵1，吕永慧1，吴宇金1，钟志勇2，武 昕2

(1.广东省广州市中医医院，广东 广州 510000；2.广东省医学实验动物中心，广东 广州 510000)

目的 建立免疫复合型溃疡性结肠炎大鼠模型并探讨其应用价值。方法 20只SD大鼠，随机分为正常对照A组10只、模型组10只。模型组用大鼠颈、背部皮下注射抗原乳化液，第23天，造模组大鼠TNBS灌肠。空白对照组以生理盐水灌肠，比较各组大便的性状、便血程度、体重下降情况，并进行组织学观察。结果 UC模型大鼠体重减轻，体重增长缓慢(P>0.05)。血清IL-10水平降低(P<0.05)。大便的性状评分、CMDI评分均升高(P<0.01)。结论 免疫复合型溃疡性结肠炎大鼠模型，该模型成功率高，重复性好，且模型的病变机制与人类UC相符，是较为理想的溃疡性结肠炎动物模型。

溃疡性结肠炎；大鼠；动物模型

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种主要累及直肠、结肠黏膜的慢性非特异性炎症。在动物试验模型的研究方面，近年来开展的UC的实验动物模型有化学诱导模型、免疫致敏模型、细胞移植模型和基因敲除模型等，其中TNBS 诱导、单纯免疫法及免疫复合法3种UC大鼠模型较为常用。免疫复合法模型的致病机制是在全身致敏的基础上给TNBS，导致迟发性变态反应造成肠黏膜的损伤，达到全身免疫异常与局部炎症病变的结合。虽然制作方法稍复杂，但免疫复合法重复性好，病变更类似人UC，持续时间长，是较理想的造模方法。免疫复合法模型病变累及全结肠以及末段回肠，溃疡病变可维持8周以上，12周后有愈合倾向，但仍可见结肠壁增厚及炎性细胞浸润[1]。本研究通过建立免疫复合型UC大鼠模型，为临床提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 动物 SD大鼠，SPF级，20只，雄性(SD大鼠)，180～200 g；新西兰兔，普通级，3只，雄性(新西兰兔)，体重3kg左右(新西兰兔)。

1.2 主要仪器 倒置显微镜(日本奥林巴斯公司，CKX41)，超净工作台(苏州净化有限公司，SW-CJ-2FD)，恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司，HWS-28)，振荡器(德国IKA公司产品，MS 3 digital)，低速冷冻离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司，KDC-2046)，全波长酶标仪(Thermo，Multiskan GO)，BS-3000A系列电子天平(精度0.1 g，上海友声衡器有限公司)，BS224S电子分析天平(感量0.0001 g，德国Sartorius)。

1.3 主要试剂 生理盐水(江西科伦有限公司，XB1402101)，冰醋酸(广州市中南化学试剂有限公司，090103)，无水乙醇(广州市中南化学试剂有限公司，101004)，双缩脲总蛋白测定试剂盒(广州上诺生物技术有限公司，20140916)，大鼠白细胞介素10(IL-10)酶联免疫试剂盒(武汉华美生物工程有限公司，E24015334)，消康保便隐血检测试纸(胶体金法)(万华普曼生物工程有限公司，14100058)，PBS(1128A14，佛山泰尔健生物科技有限公司)，胰酶(14092301，广州威佳科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组与造模 检疫合格的20只SD大鼠，随机分为正常对照A组10只、模型组10只。

1.2.1.2 对照品溶液的配制 三硝基苯磺酸TNBS溶液25 g/L：取50 g/L的三硝基苯磺酸溶液(TNBS)与50%乙醇以体积1∶1配成25 g/L的混合液。

1.2.1.3 抗原乳化液的制备 刮取新西兰兔结肠粘膜制成组织匀浆，以3000 r/min速度离心30 min，取上清液提纯，根据蛋白含量调整稀释倍数，检测蛋白含量约为20 g/L，与等量完全弗氏佐剂混合配成抗原乳化液，-20℃保存备用。

1.2.1.4 动物免疫方法 模型组大鼠全部于第1天、第14天在大鼠颈、背部皮下注射抗原乳化液(体积为0.8 mL/只动物，含抗原8 mg)，为了抗原吸收充分，注射时选取不同部位，分3～4点注射。第22天，所有大鼠禁食不禁水24 h，第23天，造模组大鼠TNBS灌肠。

1.2.1.5 TNBS灌肠方法 大鼠乙醚麻醉，将一直径2.0 mm、长约12 cm的塑胶管由肛门轻缓插入大鼠体内深约8 cm，按照TNBS 75 mg/kg的剂量，0.3 mL/100 g体重的给药体积缓慢注入含25 g/L 的TNBS乙醇溶液。然后注入约0.1 mL的空气，将留在塑胶管内的药物排入肠内。给药完毕，缓慢拔出塑胶管，用手捏住肛门，提起大鼠尾部，持续倒置1 min，使造模剂充分渗入大鼠肠腔内。

1.2.1.6 动物每组10只，5只/大箱，分4箱。每组第1箱5只连续观察14天，每组第2箱5只连续观察7天，分别于结束后按造模后处置方法处理。

1.2.1.7 造模后处置方法 戊巴比妥钠麻醉大鼠，腹主动脉采血(不抗凝)，室温放置约30 min，3000 r/min离心10 min，取上清-80℃保存待检测。放血处死大鼠，解剖，沿结肠肠系膜纵轴剪开，生理盐水冲洗，观察结肠变化，进行肠黏膜损伤CMDI评分。截取自肛门向上约10 cm肉眼观察病变明显的结肠段中性甲醛固定，进行组织病理学检查。

1.2.2 观察大鼠一般情况 体质量、大便性状、便血率.

1.2.3 肠黏膜形态及病理学检查：戊巴比妥钠麻醉大鼠，腹主动脉采血(不抗凝)，室温放置约30 min，3000 r/min离心10min，取上清-80℃保存待检测。放血处死大鼠，解剖，沿结肠肠系膜纵轴剪开，生理盐水冲洗，观察结肠变化。截取自肛门向上约10cm肉眼观察病变明显的结肠段中性甲醛固定，进行组织病理学检查。

1.2.4 CMDI评分 进行肠黏膜损伤CMDI评分，见表1。

表1 CMDI评分标准

1.2.5 白介素(interleukin，IL)-10水平测定 用ELISA法测定血浆含量，操作严格按ELISA试剂盒说明进行。

2 结果

2.1 一般观察 免疫期间，模型组动物颈、背部注射抗原乳化液部位逐渐发现皮下有小的硬块，考虑为抗原乳化液吸收不完全所致。TNBS灌肠造模后全部动物会阴部暗红色污秽，排稀便、血便，约4 d后已观察不到明显的血便，部分动物会阴部污秽和稀便症状开始逐日减轻直至消失。直至14 d给药期结束，模型组仍有两只动物排稀便，其余动物除发现会阴部少量污秽外，其余未见明显异常。正常对照A组动物整个试验期间未见异常。

造模期体重(见表2)：与正常对照A组相比，模型组各时间点的体重均有降低，但未见统计学差异(P>0.05)。

表2 UC模型大鼠给药期的体重

2.2 大便的性状评分 7天组：与正常对照A组相比，模型对照B组的大便性状评分较高(P<0.01)14天组：与正常对照A组相比，模型对照B组的大便性状评分较高(P<0.01)。

2.2 便血程度评分 肉眼观察各组大鼠粪便均未见到模型血便，OB试卡检测大便的隐血情况均为阴性，评分均为0，该指标未做组间统计分析。

2.3 CMDI评分(见表3) 7天组：与正常对照A组相比，模型对照B组的CMDI评分较高(P<0.01)。14天组：与正常对照A组相比，模型对照B组的CMDI评分较高(P<0.01)。

表3 各组大鼠的CMDI评分评分

注：与正常对照A组比较，**P<0.01

2.4 IL-10(见表4) 7天组：与正常对照A组相比，模型对照B组的IL-10水平较低(P<0.05)；14天组：与正常对照A组相比，模型对照B组的IL-10水平较低(P<0.05)。

表4 各组大鼠的血清学指标

注：与正常对照A组比较，*P<0.05

3 讨论

TNBS诱导模型，属于免疫致敏模型，其机制是乙醇破坏肠黏膜屏障后，TNBS与肠组织蛋白结合形成完全抗原，导致肠黏膜发生迟发性变态反应，从而造成肠黏膜的损伤。TNBS-乙醇模型在是国内外比较公认的UC模型，也是应用最广泛的实验UC模型。该模型慢性炎症表现突出，且病程维持时间较长，价格低廉，为研究炎症慢性化的原因和探索新的治疗药物创造了条件，且该模型病变组织学改变与人类炎症性肠病相似。免疫复合物加TNBS-乙醇模型此模型是结肠黏膜组织致敏模型和TNBS-乙醇模型的结合运用，使机体发生全身免疫异常与局部炎症病变共存，得到与人UC较为相近的实验动物模型。吴玉泓等研究发现复合大鼠UC模型大鼠结肠组织MDA、NO、TNOS及iNOS含量升高，SOD、GSH-Px水平显著降低。模型组血清和结肠IL-4含量较对照组明显降低，而模型大鼠血清和结肠TNF-α含量明显升高，模型组大鼠血清IFN-γ含量明显升高。结论显示，该方法可以较好的模拟人类UC病变的慢性活动性特点，完全可以运用于临床药物评价[2]。

UC病因和发病机制至今尚未明确，目前认为可能与遗传、免疫、感染、饮食、环境及心理因素有关，其中免疫为UC发病的重要因素，特别是细胞因子发病机制越来越受到人们的重视。而促炎性细胞因子与抑炎性细胞因子之间的平衡失调所致免疫异常，被视为UC的重要发病机制[1]。IL-10等炎症细胞因子被认为能介导UC发病[3]。IL-10 又名细胞因子合成抑制因子，是由单核巨噬细胞、T细胞等多种免疫细胞产生的多效性抑制炎症性细胞因子[4]，它的主要生物学功能是抑制炎症反应和抑制促炎性细胞因子(TNF-α、IL-8、IL-1β)的释放，调节T细胞、B细胞等多种免疫细胞的增殖和分化[5]。王燕林UC通过研究发现患者血清IL-10水平增高，且与UC的病情严重程度有关[6]。

本研究结果表明：UC模型大鼠体重减轻，体重增长缓慢(P>0.05)。大便的性状评分、CMDI评分均升高(P<0.01)。血清IL-10水平降低(P<0.05)。故本模型具有成功率高，重复性好等优点，且模型的病变机制与人类UC相符，是较理想的UC动物模型，其缺点是模型制备稍繁琐、时间较长。此外，根据文献大鼠的左、右侧足跖注射抗原乳化液，在预试验过程中出现局部坏死，故改为颈、背部皮下注射。

[1]翁一洁，江丹贤.不同大鼠溃疡性结肠炎模型的比较与探讨[J].临床与医疗，2009，(5)：779-780.

[2]吴玉泓，李海龙，段永强.免疫致敏结合局部乙酸刺激法建立大鼠溃疡性结肠炎模型[J].中国实验动物学报，2010，18(1)：65-68.

[3]闫明先，李丹萍.溃疡性结肠炎的治疗[J].山东医药，2009，49(1)：109-110.

[4]庞艳华，郑长青，王铁淳，等.IL-4 和IL-13在溃疡性结肠炎中的表达[J].胃肠病学和肝病学杂志，2005，14(4)：410-412.

[5]严瑾，欧阳钦，刘卫平，等.肿瘤坏死因子-α在溃疡性结肠炎中的作用[J].中华内科杂志，2001，5(40)：266.

[6]于燕林.溃疡性结肠炎患者血清TNF-α和IL-10 的临床观察[J].医学检验，2010，17(24)：79-80.

An Experimental Study of Immune Complexes Ulcerative Colitis Rat Model

KANG Yi-bing1，LV Yong-hui1，WU Yu-jin1，ZHONG Zhi-yong2，WU Xin2

(1.TraditionalChineseMedicineHospitalofGuangzhouCity，Guangzhou510000，Guangdong；2.GuangdongMedicalExperimentalAnimalCenter，Guangzhou510000，Guangdong)

Objective：To establish immune complexes ulcerative colitis rats model and explore its application value.Methods：20 SD rats were randomly divided into a normal control group and a model group，10 rats per group.The necks and backs of the model rats were given subcutaneous injection of antigen emulsion，and in the 23rd day these rats were given TNBS enema while the control group was given saline enema.The fecal traits，fecal blood and weight loss of each group was compared and observed histologically.Results：The weight loss of UC model rats gained slowly(P>0.05).Serum IL 10 reduced(P<0.05).Both fecal trait scores and CMDI rates increased(P<0.01).Conclusion：The immune complex ulcerative colitis rat models are made highly successfully with good repeatablilty，and the model disease mechanism is consistent with human’s UC model，an ideal animal ulcerative colitis model.

ulcerative colitis，rat，animal model

2012年广东省中医药局课题(NO：20121035)；2013年广州市卫生局课题(NO：20131A011033)

康宜兵(1975.5-)，男，副主任中医师，硕士学位，主要从事的中医消化专业临床工作，研究方向：脾胃及肝胆疾病的中医诊治。E-mail：kangyibing@126.com

R285

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1007-2349(2015)10-0055-03

2015-08-17)