干细胞治疗马软组织疾病研究进展

孙亚东，王洪斌

（1.东北农业大学动物医学院，黑龙江哈尔滨150030；2.辽宁水利职业学院生物工程系，辽宁沈阳110122；3.沈阳市佳缘动物医院，辽宁沈阳110122）

干细胞是一种原始细胞，通过对称性和非对称性分化而具有自我更新和定向分化能力。分类上包括胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）和成体干细胞（adult stem cells，ASCs）。虽然 ASCs在马属动物疾病治疗上已得到一些应用［1-2］，但尚缺乏长期详实的临床数据。治疗中最常用的两种干细胞分别是脂肪组织间充质干细胞（adipose tissue mesenchymal stem cells，AT-MSCs）和骨髓源间充质干细胞（marrow-derived mesenchymal stem cells，BMMSCs）。在头尾部采集的脂肪组织用胶原酶消化培养纯化后获得AT-MSCs或者脂肪源基质混合物（adipose-derived stromal vascular fraction，ADSVF）［3］。在胸骨和髂骨采集的骨髓［4-5］，经过2周～3周的培养可以获得BM-MSCs。如果离心便得到含有血小板和少量干细胞的骨髓浓缩物［6］。ADSVF从收集到应用临床时间周期短，商业化比较成熟，临床应用更广泛，但是AD-SVF中只含有20%～40%的干细胞。除了成体组织源性的 MSCs，其他来源的MSCs包括马胎儿成纤维细胞，脐带血，胎盘，羊水组织［7-8］。其中只有商品化的胎儿成纤维细胞源MSCs在治疗马肌腱炎中的有效性得以确认［7］。虽然上述干细胞在治疗马软组织疾病临床应用比较广泛，但是仍然存在诸多问题，如安全性问题等。本文主要综述目前动物临床治疗使用干细胞的种类及治疗方法和存在的问题，期望为干细胞治疗此类疾病提供借鉴。

1 干细胞治疗软组织疾病应用

1.1 肌腱炎和悬韧带炎

目前临床主要采用直接注射或者超声波引导注射的方法治疗肌腱炎和悬韧带炎。经过培养的BMMSCs和 AT-MSCs可用于治疗马的肌腱炎［9］。Smith等首次报道BM-MSCs治疗赛马趾浅屈肌肌腱炎方法。Pacini S等［10］首次用对照试验研究BMMSCs治疗自然发生的马趾浅屈肌肌腱炎。试验组11匹马用BM-MSCs，对照组15匹用传统抗炎方法，其他条件相同。试验组中9匹马（9／11，82%）经过治疗9个～12个月后就可以重新参加比赛，并且在2年内没有复发。对照组中15匹马全部在1年内复发（平均复发时间7个月）。证明干细胞在治疗马肌腱炎比传统方法更有效。O＇Meara B等［11］对比研究文献发现和传统方法相比，BM-MSCs治疗复发比率明显下降，分别为53%和25.7%，对比治疗后重新参加比赛的次数，差异不显著。虽然上述资料均已经证实干细胞在治疗此类疾病的有效性，但是要提高治疗效果还有待进一步研究。多种因素影响干细胞治疗效果，其中包括注射过程中干细胞受到机械破坏程度、注射干细胞的数量和注射次数。为了避免注射过程中受到严重的机械破坏，可以在注射过程中使用20或23G注射针。Godwin等证明较少数量干细胞治疗效果不佳。Schnabel L V等［12］证明每个病变区域10×106个BM-MSCs具有较好的治疗效果。注射次数决定恢复情况。通常在第1次注射30d后重新评估跛行程度且进行超声波检查，如果检测结果发现改善程度小于50%，则必须要进行第2次甚至多次注射。Sole A等［13］证明对于广泛性肌腱或者悬韧带病变，采用干细胞局部静脉注射的方法更为有效。除了上述治疗方法，Kol A 等［14］证明血小板富集血浆（plateletrich plasma PRP）结合BM-MSCs也是治疗肌腱炎行之有效的方法。首次注射时使用PRP结合骨髓浓缩物，再次按先后次序使用PRP结合BM-MSCs。关于PRP和BM-MSCs二者谁更有效还有待进一步研究。关于那种方法更有效同样需要深入研究。

1.2 关节疾病

MSCs治疗骨关节炎（Osteoarthritis，OA）和软骨损伤效果已经得到证实。BM-MSCs治疗效果好于AT-MSCs［15-16］。Frisbie首次采用关节内注射干细胞治疗马腕关节骨关节炎。分别用BM-MSCs和AD-SVF治疗受损伤的关节，过70d的治疗后组间关节软骨生物化学和组织化学检查未发现不同。经过BM-MSCs注射治疗后滑膜积液情况缓解并且前列腺素E2（PGE2）浓度下降。用AD-SVF治疗后肿瘤坏死因子（TNF）-α浓度升高引起炎症反应。关于BM-MSCs关节内注射治疗OA的具体方法还需要大量的研究，目前研究支持在注射前将MSCs分化诱导［17］。培养的BM-MSCs和MSCs的治疗有效性通过实验性股骨外侧滑车脊软骨缺损模型得到验证［6，18］。Wilke M M 等［18］用BM-MSCs结合纤连蛋白移植物在第30天治疗软骨缺损比单独使用纤连蛋白移植物获得很好的关节镜和活组织检查评价结果，8个月后试验组和对照组间结果差异不显著。原因可能是活组织检查采样造成了软骨损伤及BMMSCs存活时间比较短。Fortier L A等［6］采用相似的方法（未采用活组织检查）证明BM-MSCs治疗软骨缺陷的有效性。经过短期（3个月）与长期（8个月）的临床和组织学评估发现BM-MSCs治疗效果明显提高。8个月后磁共振技术检查关节恢复非常明显。Rachel E M 等［19］用BM-MSCs结合透明质酸采用关节内注射法治疗马内侧股骨髁全层软骨缺损，1年后，实验动物安乐死后发现试验组组织修复程度及蛋白多糖浓度与对照组相比大幅度提高。组织核磁共振、组织化学和生物化学检查结果差异不显著。Dora J F等［16］研究证实33匹马关节镜手术后注射BM-MSCs治疗膝关节损伤（包括股骨内侧髁囊性病变和十字韧带损伤），和对照组相比明显降低发病率、十字韧带功能恢复。关节镜可以用来引导干细胞注射进入关节内治疗关节软骨缺损［6］。这种方法要求双导管注射系统，其中一个装有干细胞，另外一个装牛凝血酶，注射后二者混合形成类似病变大小的团块。

1.3 蹄叶炎

干细胞在治疗马蹄叶炎疾病中具有很大前景，但是关于治疗的有效性、使用方法、干细胞种类及数量等问题还有待研究。Guedes A G等［20］证实患有蹄叶炎的马缺乏表达p63的表皮干细胞，BM-MSCs是否有助于表皮干细胞的增殖以及来自其他部位皮肤的表皮干细胞能否治疗蹄叶炎还需要试验证实。在完全诊断排除其他潜在疾病的情况下，目前常用的治疗蹄叶炎方法是局部静脉注射干细胞疗法。注射数量为20×106个，注射次数因个体差异。通常需要注射2次，治疗时机是第1次在急性发作阶段，在这个阶段首要任务是控制炎症反应；第2次在2周后。虽然关节弹响发生机率低（9%），但是也影响治疗效果。为了减少关节弹响的发生，注射前可以谨慎使用非甾体类抗炎药物［21］。

2 存在问题及展望

2.1 存在问题

如果瘢痕组织已经形成，在没有获得自体干细胞时可以使用异体干细胞进行局部治疗。尽管很多研究证实 MSCs具有抗炎和免疫调节的特性［2，21］，但是马异体MSCs能否诱发宿主免疫反应还有待深入研究。Carrade D D等［21］检测脐血和胎盘源MSCs即使经过多次注射也不能诱发免疫反应。实际上成年动物源比新生动物源的MSCs更容易诱发免疫反应。由于MHC分子影响免疫原性，MHCⅡ分子的表达随着干细胞传代次数及马的个体变化很大，不是所有同一来源的MSCs都一样。有研究表明传代2代的BM-MSCs高度不均一表达MHCⅡ分子范围（0～98%），增强的MHCⅡ表达直接促使T淋巴细胞的增殖。然而，某些马的BM-MSCs前2代不表达MHCⅡ，大多数在第4代或者以后才表达，因此大多数成体源性MSCs比如BM-MSCs在临床治疗时为保持其干细胞特性只能进行有限传代。MHCⅡ类分子阴性、传代次数低、通用的BMMSCs将具有重大的临床价值。但是目前临床使用的BM-MSCs通常是MHCⅡ阳性，传代次数较多，所以其安全性的评估格外重要。

2.2 展望

干细胞在马临床软组织疾病应用中有巨大的潜力，但是还有很多问题需要解决。不同病例使用干细胞的数量、使用方法都需要深入研究。随着组织工程技术的进一步发展，干细胞与组织工程材料之间的相互作用及组织工程材料对干细胞向受损伤组织趋化的作用是未来研究的主要方向。异体干细胞移植的免疫排斥性问题也很重要。通常认为干细胞不能诱发免疫反应，但是超过90%早期培养的干细胞表达MHCⅡ分子，所以这些干细胞也能诱发免疫反应。由于异体移植的免疫排斥、急性发作期的马不能立即获得自体干细胞，所以寻找万能的BMMSCs供体将是未来临床需要研究的重要课题之一。由于干细胞治疗需要大量细胞，成体组织中细胞数量往往不足，所以如何能提供充足的种子细胞也是细胞治疗的重要问题。诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）由于其特性具有巨大的临床应用潜力，未来或许可以解决BMMSCs细胞数量不足的问题［22］。

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