羊用布鲁菌病疫苗研究进展

付湘云，马小菁，易新萍，叶　锋，谷文喜，钟　旗＊（1.新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐83005；.新疆畜牧科学院兽医研究所，新疆乌鲁木齐830000）



羊用布鲁菌病疫苗研究进展

付湘云1，2，马小菁2，易新萍2，叶锋2，谷文喜2，钟旗2＊
（1.新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐830052；2.新疆畜牧科学院兽医研究所，新疆乌鲁木齐830000）

摘 要：布鲁菌病是重要的人兽共患病，对畜牧业发展和人类健康威胁严重。疫苗免疫仍是目前预防和控制动物布鲁菌病的措施之一，用于羊布鲁菌病防控有多种疫苗，如S19、RB51、Rev.1等，每种疫苗均各有利弊。现今，众多研究者也通过基因工程等技术积极研究DNA疫苗、基因缺失疫苗、亚单位疫苗等。论文就羊用布鲁菌病疫苗的应用及新型疫苗的研究现状进行综述，以期为羊布鲁菌病的预防提供参考。

关键词：羊；布鲁菌病；疫苗；预防；家畜

布鲁菌病（Brucellosis）是由布鲁菌（Brucella）引起的一种人畜共患的传染性疾病。布鲁菌属细菌大多数种型对人畜有致病性，对人畜皆有致病作用的是羊种布鲁菌（B.melitensis）、牛种布鲁菌（B.abortus）、猪种布鲁菌（B.suis）和犬种布鲁菌（B.canis），对畜有致病而对人无致病作用的是绵羊附睾种布鲁菌（B. ovis），对人畜皆无致病的是沙林鼠布鲁菌（B.neotomae）［1-2］。其中羊种布鲁菌对人有较强的致病力，由其引起的人间布鲁菌病在多个国家和地区有流行，如地中海地区、伊朗、俄国、蒙古国和中国北部［3］。近年来，随着我国畜牧业的快速发展，布鲁菌病疫情在人间和畜间均呈逐年上升的趋势，流行病学调查表明，90%以上的致病菌为羊种布鲁菌3型［4-6］。对该病的防控仍以疫苗接种为主。不同种类的布鲁菌表现的致病力也不相同，这除了与菌体本身的成分相关外，还与宿主的状态有关系。本文对羊布鲁菌病疫苗研究进展做一概述，以期为该病有效防控提供参考。

1　光滑型羊用布鲁菌弱毒活疫苗

由于活疫苗能激起机体有效的细胞免疫，产生良好保护效果，目前仍被广泛使用。

1.1羊种Rev.1疫苗

Rev.1株是由Elberg等［7-8］1957年从B.melitensis强毒株6056血清Ⅰ型中分离的一株羊种布鲁菌，具有链霉素抗性。Rev.1减毒活疫苗对牛、羊布鲁菌均具有免疫保护力，皮下免疫绵羊和山羊，可抗B. melitensis和B.ovis菌感染，保护力为80%～90%。但该菌株作为疫苗有一定毒性，且在适当的条件下毒力可完全恢复，孕羊不宜使用。作为羊种布鲁菌病疫苗株的代表，Rev.1在欧洲大部分国家和亚洲部分国家被广泛用于绵羊、山羊布鲁菌病的防控，且一直保持良好效果，我国并未引进该疫苗。

1.2羊种M5疫苗

中国农业科学院哈尔滨兽医研究所于1962年将B.melitensis强毒株M28传代致弱为M5疫苗株。我国于1970年开始大规模使用，广泛用于羊的免疫，对当时控制羊布鲁菌病起到了良好作用。但M5疫苗菌株不稳定，是我国目前使用的疫苗中毒力最强的，常出现从S型到R型的变异，菌落大小也不均匀。目前我国已基本停止了该疫苗的生产。

1.3猪种布鲁菌疫苗S2

猪种S2疫苗株由中国兽药监察所1953年由进口猪的流产胎儿中分离出来，在人工培养基上移植7年后变成弱毒株。20世纪70年代开始将猪种布鲁菌S2疫苗正式用于羊的免疫，20世纪80年代中期该疫苗被土耳其、法国、德国、西班牙等国家引进并用于试验研究。作为弱毒活疫苗，S2具有使用范围广和使用方便的特点，毒力比S19弱，可供猪、牛、牦牛、山羊和绵羊等多种动物皮下注射、肌肉注射、口服多种途径接种。S2突出的优点还在于通过口服方式免疫怀孕母畜不会引起流产，使用方便，对绵羊的保护率为80%；对山羊的保护率80.3%［9］。因此，该疫苗在我国有广泛应用，但该疫苗注射法不能用于孕畜及小尾

寒羊的免疫。

1.4牛种布鲁菌疫苗S19

有研究从牛奶中分离到B.aborus菌，经实验室传代自然减毒，成为一株毒力稳定的弱毒疫苗S19。1940年后该疫苗逐渐在美国各地推广使用。S19苗有产生免疫力保持时间长的优点，对牛和绵羊免疫效果较好，免疫保护率达65%～75%。我国在20世纪60年代引进过一株布鲁菌疫苗，简称A19。研究表明，A19与S19菌株序列上存在差异，即S19疫苗株缺失赤藓醇代谢基因（Ery）的702碱基，而A19菌株则无此缺失［10］。S19疫苗仍为世界范围内广泛应用的布鲁菌病参考疫苗，但本疫苗不能接种于孕羊。

以上4种光滑性弱毒活疫苗虽然具有较好的免疫效果，但也存在问题。①接种疫苗后，个别家畜可出现流产、排菌现象。②某些疫苗不能用于孕畜，如S19、Rev.1。③接种疫苗后产生的血清学反应与感染相似，造成诊断困难。因此，研制预防布鲁菌病的有效疫苗，建立完善的区分布鲁菌免疫与自然感染动物的方法是普及免疫接种的研究方向。

2　粗糙型羊用布鲁菌疫苗

2.1RB51疫苗株

RB51疫苗株最初由光滑型牛布鲁菌2308株经体外反复传代，并经利福平和青霉素的筛选获得的稳定的R型菌株。由于其免疫后动物血清中不产生O-链抗体，因此可用血清学方法来鉴别诊断免疫动物和自然感染动物。相对于45/20，RB51疫苗株相当稳定，对山羊有良好的免疫保护效果并不干扰诊断结果，目前在很多国家应用［11］。由于知识产权受限和技术封锁等方面原因，我国尚未引进RB51疫苗株。

2.216M-△wboA疫苗株

wboA基因编码糖基转移酶是合成O-侧链多糖的必需基因之一。利用wboA基因突变获得源于羊种布鲁菌强毒株16M的疫苗株，即粗糙型16M-△wboA疫苗株。该突变菌株具有卡那霉素抗性，插入了Tn5元件，不表达O-侧链。因此，该疫苗免疫动物后，在动物机体内检测不到针对O-侧链的抗体，从而可避免干扰血清学诊断。另外，该菌株不会引起怀孕母畜流产，但其疫苗保护效果有待进一步的研究。

2.3羊种布鲁菌H38灭活疫苗

1964年Renoux等将马耳他布鲁菌53H38号强毒菌株的培养液，经福尔马林灭活后与mayoline（一种轻质石蜡油）及rlace A（一种经特别处理过的甘露醇单油酸脂）混合搅拌制成的乳化佐剂苗。该佐剂H38疫苗属于S型羊种布鲁菌，在山羊和绵羊应用中效果比S19疫苗好，且与ReV.1苗相近。该疫苗对动物安全，不影响接种动物以后的生长和繁殖，但有局部副作用，可能引起注射部位化脓，同时血清学反应也呈阳性，干扰诊断。另外，在疫苗制备的灭活过程中抗原表位易丢失，用量大，无内源性蛋白产生所以不能诱导CTL，这些缺点都限制了其进一步应用。H38疫苗主要在法国应用，其他国家鲜有应用。

3　基因工程疫苗

20世纪70年代以来，迅速发展的重组DNA技术为疫苗的研究提供了新的手段。鉴于现有布鲁菌病疫苗都不同程度的存在安全性差的问题，而基因工程疫苗克服了传统疫苗的易返祖、影响接种动物等缺陷，其安全问题比较容易控制和处理，因此基因工程疫苗如DNA疫苗、亚单位疫苗、基因缺失疫苗等成为研究热点。

3.1亚单位疫苗

基因工程亚单位疫苗（subunit vaccine）又称生物合成亚单位疫苗或重组亚单位疫苗，是将保护性抗原基因在原核或真核细胞中表达，并以基因产物蛋白质或多肽制成疫苗。亚单位疫苗的有效性取决于目标抗原，筛选最佳抗原是重组蛋白疫苗研究的基础。研究表明，布鲁菌外膜蛋白Omp16、Omp19、Omp28、Omp31可以诱导Th1型的细胞免疫反应，且能够对小鼠提供与S19和RB51疫苗相当的攻毒保护。另外，Omp31与氢氧化铝或弗氏不完全佐剂联合使用，也能对羊种布鲁菌的攻毒提供较高的攻毒保护。如保护性抗原CobB、AsnC、胞质蛋白SurA和DnaK、周质蛋白Cu-Zn、核糖体蛋白L7/L12均能够诱导小鼠产生较强的抗体反应，且能够对小鼠提供与S19疫苗相当的攻毒保护。

与传统疫苗相比，亚单位疫苗抗原成分单一，可用血清学方法有效的鉴别，其抗原为蛋白质，与其他新型疫苗相比不会发生可能出现的基因重组问题，比较安全。但是亚单位疫苗在体内不能复制，免疫原性不及常规疫苗，免疫效果在很大程度上还依赖于免疫佐剂和接种途径，而且该类疫苗在生产上工艺复杂，成本高，故直至目前仍未能普遍推广。

3.2DNA疫苗

DNA疫苗指直接把含有目的抗原基因的重组质粒转染或注射到动物细胞中，使之在细胞内持续表达出天然的抗原物质，诱导特异性细胞毒性T细胞（CTL）及Th1型免疫应答。在布鲁菌感染的小鼠模型中，许多抗原基因已经被作为DNA疫苗进行研制，如L7/L12核糖体蛋白、细胞周质蛋白p39、Cu-Zn超氧化物歧化酶、热休克蛋白GroEL、外膜蛋白

Omp31、Omp25等基因［12-15］。小鼠试验表明，这些蛋白都可以激活T细胞反应，包括活化巨噬细胞和CD8细胞毒性T细胞，激活机体的免疫应答系统而起到保护作用，有效的抵抗布鲁菌的感染。研究报道，小鼠模型研究获得有效的布鲁菌DNA疫苗接种于较大动物并非全部获得与小鼠同样的结果，提示相关DNA疫苗的研制尚需进一步改进。DNA疫苗的生物安全性问题，如诱导免疫耐受和自身免疫疾病的产生、基因的稳定性、抗性基因的转移等仍需考虑和进行全面评价，因此这类疫苗仍停留在实验室阶段。

3.3新型标记疫苗

由于人工免疫和自然感染动物所表现的临床症状相似，很难鉴别是人工免疫还是自然感染动物，给动物的检疫、运输、宰杀带来困难。而分子标记疫苗能解决这样的问题。在减毒活疫苗株的基础上，对菌株进行改造，缺失布鲁菌的重要诊断抗原基因使疫苗株的毒力进一步降低，然后根据两者序列的差异，建立鉴别PCR的方法，以区分人工免疫和自然感染。

3.3.1Rev.1标记疫苗 1998年，Tibor等用基因置换技术构建了布鲁菌工程苗，以抗卡那霉素基因置换羊种布鲁菌疫苗基因Rev.1的p39胞质结合蛋白，获得Rev.1-△p39疫苗。布鲁菌p39是一种很好的T细胞抗原，能诱发强烈的迟发性超敏反应，并产生大量的INF-γ，纯化的重组p39对于动物布鲁菌病的血清学诊断是一个优良的抗原。Rev.1-△p39疫苗接种动物后，动物将不能对P39产生免疫反应，进而判定动物是否为自然菌株感染。

Grillo M J等［16-18］在Rev.1疫苗株的基础上分别构建了删除bp26基因的CGV26菌株和删除bp26与Omp31基因的CGV2631菌株。研究表明，CGV26与Rev.1的免疫保护力相当，并且显著高于CGV2631，该菌株免疫动物后产生的抗体中不含有bp26蛋白的抗体，从而可以与自然感染相区分。

由于我国尚未引进Rev.1疫苗株，因此国内鲜有关于Rev.1相关标记疫苗的报道。目前M5在国内基本停产，Rev.1作为一株羊布鲁菌疫苗株应该可以作为一个很好的基础菌株，通过缺失重要的抗原分子以期获得毒力降低、能与自然感染想区别的良好新型标记疫苗。

3.3.2M5-90标记疫苗 由于M5疫苗株有可能引起孕畜流产、对接触气雾人员有较大不良反应、连续通过豚鼠传代后毒力有回升现象等缺点，哈尔滨兽医研究所将M5在鸡成纤维细胞中传代90次培育而成M5-90。但培育出来的M5-90仍存在以下缺点：免疫怀孕动物仍可能导致流产、用常规血清学方法检测不能区分自然感染和疫苗感染，因而限制了该疫苗广泛推广应用。有研究者［19］以M5-90疫苗株为亲本株成功构建了bp26基因缺失的M5-90疫苗株，该基因缺失菌株免疫动物后产生的抗体中不含有bp26蛋白的抗体，从而可以与自然感染相区分。2010年，李臻等［20］通过同源重组的方法构建布鲁菌M5-90疫苗株virB2基因缺失株，该缺失株在10代以内未发生回复突变。这些标记疫苗目前仍处于实验室研制阶段。

3.3.316M标记疫苗 布鲁菌PurE基因是嘌呤合成的必需基因，以羊种布鲁菌16M为基础，构建了缺失PurE羊种布鲁菌基因缺失突变活疫苗16M-△PurE，该菌株由于缺失PurE基因，造成16M布鲁菌从头合成次黄嘌呤障碍，使该疫苗在体内体外都减毒，目前，16M-△PurE候选标记疫苗在进行保护性效力评估。

以上新型布鲁菌标记活疫苗作为当今布鲁菌病新型疫苗研究的重要领域，有其他疫苗无法比拟的优势，主要包括：①保留了原有减毒活的免疫保护效果；②能完全模拟天然细菌免疫，在宿主体内持续存活，刺激机体产生全面而持久的免疫力（包括细胞免疫CM I和体液免疫HT）；③基因同源重组技术的应用，解决了传统减毒活疫苗存在的残余毒力强的问题，提高疫苗使用安全性；④解决了布鲁菌病疫苗免疫与自然感染的血清学鉴别诊断问题。但这些疫苗仍在试验阶段，其临床应用还需进一步评估和完善。

4　展望

布鲁菌病是一种全球性的人畜共患病疾病，带菌的动物是其他动物和人类布鲁菌病的主要传染源，疫苗免疫是预防和控制布鲁菌病的有效途径。流行病学调查研究表明，我国近几年畜间布鲁菌流行种型主要以羊种布鲁菌3型为主，而羊是羊种布鲁菌3型的适宜宿主。考虑到我国现阶段羊的患病率高、养殖基数大等现状，我国主要采取以疫苗接种为主和检疫-扑杀为辅的布鲁菌病防控策略。现阶段羊用疫苗主要有猪布鲁菌疫苗株S2和羊布鲁菌疫苗株M5（国内目前没有厂家生产）。虽然这两种疫苗为有效地控制布鲁菌病提供了重要保障，但同时也存在一定的缺陷，即疫苗缺乏鉴别诊断标记，无法甄别接种动物与自然患病动物，造成布鲁菌无法在畜群中根除，影响了布鲁菌病的诊断、检疫。因此，研发安全性高、保护性免疫活性好的新型标记疫苗仍是当今布鲁菌病疫苗研究的热点。

随着现代细菌生物学技术的不断发展，人们己将羊种布鲁菌的基因进行了全部测序，对各种蛋白基因的结构与功能、毒力基因与细菌感染和免疫的关系都

做了更深入的研究。与传统疫苗相比，亚单位疫苗的抗原成分单一，可以用血清学方法鉴别，由于其抗原为蛋白质，因此不会出现潜在的安全性问题。因此，应用分子生物学技术构建基因缺失或基因获得性多价疫苗成为布鲁菌病新型疫苗研究的重点。但布鲁菌病疫苗应用的实践证明，弱毒活疫苗是控制动物布鲁菌病的最有效方法。因此，通过分子生物学技术对现有活疫苗进行遗传改造，筛选保护力高的具有诊断标记的弱毒疫苗的研究应用前景十分可观，该类标记弱毒活疫苗提升原有疫苗的功能，弥补了疫苗无法鉴别诊断的缺陷，缩短了疫苗上市生产应用周期，将会对我国布鲁菌病提供有效的预防。

参考文献：

［1］ 毛景东，王景龙，杨艳玲.布鲁氏菌病的研究进展［J］.中国畜牧兽医，2011，38（1）：222-227.

［2］ Posadas D M，Ruiz-Ranwez V，Bonomi H R，et al.BmaC，a novel autotransporter of Brucella suis，is involved in bacterial adhesion to host cells［J］.Cell Microbiol，2012，14（6）：965-982.

［3］ Chen Y，Ke Y，Wang Y，et al.Changes of predominant species/biovars and sequence types of Brucellaisolates，Inner Mongolia，China［J］.BMC Infect Dis，2013，11（13）：514.

［4］ Hamed R A R，Reza A，Mohammad S，et al.Brucella meningitis ［J］.Med J Islam Repub Iran，2013，27（2）：99-100.

［5］ 周晓艳，陈燕芬，崔步云，等.我国羊种3型布鲁氏菌的多位点序列分型研究［J］.人兽共患病学报，2011，27（5）：371-375.

［6］ Aras Z，Ates M.The first report of isolation and molecular characterization of Brucella melitensis Rev-1vaccine strain from an aborted sheep fetus in Turkey［J］.Small Ruminant Res，2011，95（2-3）：150-159.

［7］ Avila-Calderón E D，Lopez-Merino A，Jain N，et al.Characterization of outer membrane vesicles fromBrucella melitensis and protection induced in mice［J］.Clin Dev Immunol，2012，20（12）：1-13.

［8］ Bardenstein S，Mandelboim M，Ficht T A，et al.Identification of the Brucella melitensis vaccine strain Rev.1in animals and humans in Israel by PCR analysis of the PstI site polymorphism of its omp2 gene［J］.J Clin Microbiol，2002，40：1475-80.

［9］ 戎瑞雪.WboA基因在布鲁菌S2株诱导机体免疫应答中的作用［D］.河北保定：河北大学，2014：11-12.

［10］ 吴冬玲，钟 旗，谷文喜，等.3株牛布鲁氏菌19疫苗株赤藓醇代谢基因的克隆与序列分析［J］.新疆农业大学学报，2008，31 （2）：59-62.

［11］ Avila-Calderón E D，Lopez-Merino A，Sriranganathan N，et al.A history of the development of Brucella vaccines［J］.Biomed Res Int，2013，6（3）：1-8.

［12］ Lim J J，Kim D H，Lee J J，et al.Protective effects of recombinant Brucella abortus Omp 28against infection with a virulent strain of Brucella abortus 544in mice［J］.J Vet Sci，2012，13（3）：287-292.

［13］ Pasquevich K A，Bafiez A E，Coria L M，et al.An oral vaccine based on U-Omp19induces protection against Brucella abortus mucosal challenge by inducing an adaptive IL-17immune responsr in mice［J］.PLoS One，2011，6（1）：e16203.

［14］ Barquero-Calvo E，Martirosyan A，Ordonez-Rueda D，et al.Neutrophils exert a suppressive effect on Th1responses to intracellular pathogen Brucella abortus［J］.PLoS Pathog，2013，9（2）：103-117.

［15］ 石艳春，韩 堃，郑源强，等.羊布鲁氏菌omp25基因原核表达载体的构建与鉴定［J］.内蒙古医学院学报，2012，34（2）：89-92.

［16］ Oliveira S C，Giambartolomei G H，Cassataro J.Confronting the barriers to develop novel vaccines against brucellosis［J］.Expert Rev Vac，2011，10（9）：1291-1305.

［17］ Grillo M J，Marin C M，Barberan M，et al.Efficacy of bp26and bp26/omp31 B.melitensis Rev.1deletion mutants against Brucella ovis in rams［J］.Vaccine，2009，27：187-191.

［18］ 丁家波，冯忠武.动物布鲁氏菌病疫苗及其研究进展［J］.生命科学，2013，25（1）：91-99.

［19］ 王 真，HAN Gilsu，吴清民.动物布鲁氏菌病疫苗的来历及亚单位疫苗的研究概况［J］.中国农业大学学报，2014，19（3）：169-174.

［20］ 李 臻，张红星，唐利燕，等.布鲁氏菌M5-90疫苗株VirB2基因缺失株的构建及鉴定［J］.微生物学报，2010，50（12）：1677-1680.

Advance in Brucellosis Vaccines in Sheep and Goats

FU Xiang-yun1，2，MA Xiao-jing2，YI Xin-ping2，YE Feng2，GU Wen-xi，ZHONG Qi2
（1.College of Veterinary Medicine，Xinjiang Agricultural University，Urumuqi，Xinjiang，830052，China；2.Institute of Veterinary Research，Xinjiang Academy of Animal Science，Urumuqi，Xinjiang，830000，China）

Abstract：Brucellosis is a serious zoonosis with a worldwide impact，contributing to significant health and economic problems.It is caused by bacteria of the genus Brucella.Brucellosis remains of particular concern due to the transmission of this severe disease to humans，which it can occur through the consumption of unpasteurized dairy products.Vaccination is one of the most effective measures to control brucellosis.Up to now，there are several vaccines such as S19，Rev.1and RB51used in domestic and abroad，also serologic and molecular biology methods can not distinguish natural infection from vaccination.These drawbacks interfere epidemiological investigation and epidemic focus research.For the reason，the paper reviewed the application of research status of brucellosis vaccines used in sheep and goats.

Key words：sheep and goat；Brucellosis；vaccine；prevention；livestock

通讯作者

作者简介：付湘云（1989-），女，新疆昌吉人，硕士研究生，主要从事动物医学研究。＊

基金项目：自治区高技术研究发展计划（201311102）

收稿日期：2014-09-23

中图分类号：S852.614

文献标识码：A

文章编号：1007-5038（2015）05-0091-04