嗜吞噬细胞无形体对宿主细胞影响研究进展

张　艳，宁长申（河南农业大学牧医工程学院，河南郑州450002）



嗜吞噬细胞无形体对宿主细胞影响研究进展

张艳，宁长申＊
（河南农业大学牧医工程学院，河南郑州450002）

摘 要：嗜吞噬细胞无形体是一种革兰阴性菌，专性细胞内寄生，可经蜱传播。主要侵染宿主的髓系细胞和非髓系细胞，引起动物蜱传热病和人粒细胞无形体病。论文总结了近年来与嗜吞噬细胞无形体入侵宿主细胞相关的蛋白质，如主要表面蛋白MSP2、外膜蛋白OmpA、嗜吞噬细胞无形体表面蛋白AipA等的研究成果，以及该病原菌进入宿主细胞后引起的宿主细胞的变化，如激活一系列蛋白激酶、抑制氧化反应和炎症反应、干扰自噬作用等影响及其可能的机制。关于嗜吞噬细胞无形体，还有很多领域的问题亟待研究解决，国内外许多学者致力于研究该病原菌与宿主细胞的互作，以期找出嗜吞噬细胞无形体如何影响宿主细胞的信号传导和相关基因的表达，从而逃避宿主免疫系统并在其中正常生存的机制。

关键词：嗜吞噬细胞无形体；宿主细胞；影响

嗜吞噬细胞无形体（A.phagocytophilum）属于甲型变形菌纲，立克次体目，无形体科，无形体属。直径0.4μm～1.3μm，个别可达2μm，专性胞内寄生，由双层膜包裹的多形性球菌，外膜多褶皱，具有革兰阴性的细胞壁，该病原菌存在于真核细胞胞质中与膜结合的空泡内，并从其中获取营养物质进行二分裂繁殖，由于缺乏肽聚糖和脂多糖生物合成体系，因此该病原菌对机械压力（如超声波，冻融，渗透压变化等）非常敏感［1］。电镜观察可见嗜吞噬细胞无形体常以两种形态存在，即网状体和致密体（DC）。致密体直径多为1.5μm～2.5μm，个别可达6μm。蛋白质组学研究表明，网状体只是嗜吞噬细胞无形体发育过程中的中间体形式，不具备感染哺乳动物细胞的能力，而致密体致密的类核不仅可以抵抗外界环境变化，而且可使该病原菌获得侵染哺乳动物细胞的能力［2］。嗜吞噬细胞无形体适宜在髓系细胞或粒细胞中生长，其主要的宿主细胞是粒细胞，也可侵染内皮细胞［3］。目前已在人早幼粒细胞HL-60、早幼粒细胞白血病细胞KG-1、髓单核细胞THP-1、内皮细胞培养物和蜱细胞培养物中成功培养嗜吞噬细胞无形体［4］。该病原可感染人类、鹿、犬、猫、马、反刍动物、啮齿类动物等，导致感染动物发生蜱传热、无形体病。无形体病的主要临床症状有高热、食欲不振、精神萎靡，还可引起怀孕母畜流产等［5-6］。

1　嗜吞噬细胞无形体蛋白质研究

尽管嗜吞噬细胞无形体的基因组研究有助于揭示该病原菌的结构和功能，然而研究得较为清楚的蛋白质数量非常有限。嗜吞噬细胞无形体中含量最多的蛋白质是主要表面蛋白2（MSP2/p44），由多基因家族编码，该多基因家族可能与嗜吞噬细胞无形体的宿主偏好性有关。嗜吞噬细胞无形体基因组中含有133 个MSP2/p44基因位点，编码该基因家族的一系列外膜糖蛋白，后者参与了病原菌的多种生物学过程，如抗原多样性、宿主适应性、细菌黏附和膜孔蛋白活性等［1］。MSP2基因的变化导致了不同地区嗜吞噬细胞无形体株型间抗原的多样性，而这种多样性则可能由免疫选择诱发，导致病原菌在宿主中的长期感染。但有趣的是，该病原菌在细胞中经多次传代后，MSP2基因的转录和蛋白质的表达受到抑制，表明该病原菌会选择适宜其生存的新宿主细胞，这一发现证明MSP2在细胞黏附方面有重要作用［1，7］。嗜吞噬细胞无形体能结合在中性粒细胞和粒细胞表面的岩藻糖基化和唾液酸化的骨架蛋白上。目前研究最多的配体是P-选择素糖蛋白配体-1（PSGL-1/CD162），嗜吞噬细胞无形体部分通过MSP2黏附在该配体上［7］。MSP2是黏附复合物的一个组成部分，该复合体除包含MSP2寡聚体外，还含有一些其他膜蛋白，如糖基磷脂酰肌醇（GIP）锚定蛋白（GAP）和Flotillin 1，这二者对病原

菌与宿主细胞的结合是必须的［8］。当病原菌以内体的形式被宿主细胞内化后，内体即不再积累晚期内体的标记分子，从而不能发育至成熟阶段。内化是通过胞吞途径完成的，病原菌的内化也影响了宿主细胞的胞吞过程，导致空泡不再被酸化或融合入溶酶体。

除了MSP2，另外一个研究较多的蛋白质是锚蛋白A（AnkA）［9］。该蛋白质的分子量为153ku～160 ku，包含氨基端的至少11个锚蛋白重复序列和1个羧基端短随机重复序列。AnkA蛋白是目前研究者发现的Ⅳ型分泌系统两个效应分子之一。嗜吞噬细胞无形体感染导致AnkA蛋白的酪氨酸残基发生磷酸化，磷酸化后的蛋白与宿主的酪氨酸磷酸酶SHP-1相互作用。AnkA蛋白在感染的粒细胞胞核中与染色质形成复合物。虽然关于AnkA蛋白是否影响嗜吞噬细胞无形体在宿主细胞中的存活还知之甚少，但它是目前已知的由该病原菌分泌的唯一一个蛋白质，它可能是通过嗜吞噬细胞无形体Ⅳ型分泌系统穿过病原菌和空泡膜，再进一步穿过细胞质膜和核膜进入细胞核内。在感染的中性细胞或HL-60细胞核中，AnkA与核蛋白质结合，随后该复合体结合在DNA上缺乏保守区域的富含AT碱基的部位［9］，该蛋白只存在于受感染细胞的核中，可能这一结合会影响靶细胞中某些基因的转录，然而，AnkA是怎样发挥作用影响真核基因转录的，还需要进一步的研究来证实。

在嗜吞噬细胞无形体附着和入侵宿主细胞这一过程中研究的较透彻的是两种表面蛋白，即外膜蛋白A（OmpA）和14ku的A.phagocytophilum表面蛋白（Asp14）。OmpA氨基端胞外结构域中的19-74位氨基酸残基可结合PSGL-1的路易斯抗原，当使用OmpA的抗体或重组OmpA全长蛋白或仅其氨基端结构域处理宿主细胞后，病原菌的进入都受到抑制［10］。Asp14对病原菌的侵入也是很关键的，其发挥作用的结构域是蛋白质羧基端12-24位氨基酸残基。使用Asp14或OmpA重组蛋白单独预先处理宿主细胞，可使病原菌的感染率减少57%～65%，而用两者同时处理，则可使感染率下降90%，可见二者在促进病原菌入侵方面具有协同作用［11］。最新的研究表明，嗜吞噬细胞无形体表面蛋白AipA可介导病原菌入侵宿主细胞，该蛋白的1-87位氨基酸残基对其发挥作用是必需的，进一步的试验表明，该结构域中的9-21位氨基酸残基介导了病原菌的入侵。使用AipA 1-87位氨基酸残基结合Asp14以及OmpA重组蛋白几乎可完全阻断嗜吞噬细胞无形体的感染［12］。

Ⅳ型分泌系统的另外一个效应分子是无形体转位基质-1（Ats-1）蛋白，它是在有目的地筛选嗜吞噬细胞无形体Ⅳ型分泌系统的效应分子时发现的［13］。Ats-1以依赖受体的形式跨过5层膜到达线粒体。Ats-1能抑制依托泊苷依赖的细胞色素C的释放以及多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）的剪切，而后两者与细胞凋亡是密切相关的［13］。Huang B等［14］对含有嗜吞噬细胞无形体的空泡相关蛋白进行了一系列研究，结果显示定位在空泡膜上的APH-1387在该病原菌胞内发育的整个过程中都有表达，然而，同样位于空泡膜上的APH-0032只在感染的后期才有表达［15］。研究者利用抗体中和试验证实致密体形态蛋白APH-1235在嗜吞噬细胞无形体感染宿主细胞的过程中也发挥作用，然而具体的机制还有待研究［16］。

2　嗜吞噬细胞无形体感染后宿主细胞的变化

嗜吞噬细胞无形体进入HL-60细胞后导致PSGL-1信号通路的活化，进而激活酪氨酸激酶（Syk），后者可将ROCK1磷酸化［35］，ROCK1是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，可调节肌动蛋白（actin）的组装，由此推测由ROCK1活化引起的actin的重组促进该病原菌进入靶细胞［17］。另有研究表明，嗜吞噬细胞无形体可通过依赖PSGL-1和不依赖PSGL-1两种途径感染哺乳动物细胞［18］。后者不需要Syk蛋白的参与，同时AnkA蛋白向核内的转运也会减少。有研究表明，嗜吞噬细胞无形体可调节PI3K/AKT信号通路，该通路又可通过调控抗凋亡蛋白Mcl-1的表达进而影响中性粒细胞的凋亡过程［19］。另外一组学者的研究表明，嗜吞噬细胞无形体可活化ERK信号通路，并证实与中间丝状体蛋白波形蛋白共定位的毒力分子AptA促使Erk1/2发生磷酸化［20］。

嗜吞噬细胞无形体的组氨酸激酶PleC和二鸟苷酸环化酶PleD组成双组分系统，这一系统在该病原菌的胞内感染过程中发挥作用，活化的PleD产生cdi-GMP，后者能使嗜吞噬细胞无形体在哺乳动物细胞中定殖［21］。单核细胞受到嗜吞噬细胞无形体感染后，p38MAP激酶、PKC、PKA和PTK在促炎细胞因子的分泌方面有重要作用［8］。而在中性粒细胞中，p38 MAP激酶可使嗜吞噬细胞无形体抑制宿主细胞的凋亡［22］。嗜吞噬细胞无形体可通过清除由吞噬细胞氧化酶产生的过氧化物而在其最初侵染的宿主细胞中存活下来，这一过程可能是借助于其自身的超氧化物歧化酶实现的。受感染的HL-60细胞因为吞噬细胞氧化酶复合物（包括gp91phox/NOX2和Rac2）转录表达的减少而不能产生呼吸暴发［23］。吞噬细胞氧化酶的减少还可能产生其他效应，如局部炎症调节作用受到抑制。嗜吞噬细胞无形体感染导致人中性粒细胞释放IL-8，后者可招募中性粒细胞至感染部位，进

而成为病原菌新的靶细胞［24］。嗜吞噬细胞无形体感染还可引起中性粒细胞迁移率下降以及炎性内皮部位白细胞渗出减少，这两种效应抑制了炎症反应，促进该病原菌在宿主细胞内的生存［25］。

中性粒细胞的半衰期通常很短，所以病原菌要在其中生存，就必须干扰宿主细胞正常的凋亡程序。活化的中性粒细胞在24h～48h内进入程序性细胞死亡。嗜吞噬细胞无形体感染后，中性粒细胞的凋亡过程被推迟约24h［26］。这是由于嗜吞噬细胞无形体感染后，抗凋亡基因blc-2的表达量增加，中性粒细胞自发凋亡过程中Fas的聚集被阻断，酶原8的剪切受到抑制，半胱天冬酶8得到活化，Bax向线粒体的转位受到抑制，半胱天冬酶9得到活化以及半胱天冬酶抑制子XIAP的降解［1，27］。有研究表明，嗜吞噬细胞无形体感染还能激活PI3K/AKT信号通路，该信号通路可增加抗凋亡蛋白Mcl-1的表达，同时活化NFκB，进而促进感染细胞IL8的分泌，延迟宿主细胞的凋亡［19］。另外嗜吞噬细胞无形体的T4SS分泌的Ats-1可阻止线粒体对凋亡信号产生响应［13］。嗜吞噬细胞无形体的桑椹体由双层脂膜包裹，并有自噬体的一些标记分子，如LC3、beclin-1、ATG 8和ATG 6［28］。嗜吞噬细胞无形体感染早期，病原菌包涵体分泌Ats-1进入细胞质，与Beclin1和ATG 14结合从而诱导omega体的形成，进一步地形成一个由双层膜包裹的表面标记有LC3的自噬体，随后与病原菌包涵体融合，并向空泡腔内转运自噬体样的小泡［29］。用自噬作用的诱导剂雷帕霉素处理宿主细胞后，嗜吞噬细胞无形体的感染进一步加强，而用抑制自噬作用的3-甲基腺嘌呤处理后，病原菌的生长受到抑制然而其内化未受影响。这一对比试验表明自噬作用受到抑制有利于嗜吞噬细胞无形体在宿主细胞内的生长［28］。

3　展望

目前，在世界范围内嗜吞噬细胞无形体已经成为一个危害公众健康的重要蜱传病原菌。虽然嗜吞噬细胞无形体的基因组很小，并且是专性胞内寄生，但是它既能在哺乳动物中性粒细胞中正常生长繁殖，也能在传播媒介节肢动物体内完成生长周期，并通过一系列复杂的机制影响宿主细胞的凋亡过程和自噬作用，抑制宿主细胞正常的杀菌活性，最终导致机体感染的发生。然而，在这一过程中还有很多重要的问题亟待解决，例如，病原菌通过哪一个配体引起宿主的炎症反应；先天性免疫反应和适应性免疫反应在其中各自的作用以及如何受到调控等。关于专性胞内寄生菌，未来要做的工作还有很多。

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Progress on Effects of A.phagocytophilumon Host Cells

ZHANG Yan，NING Chang-shen
（College of Animal Science and Veterinary Medicine，Henan Agricultural University，Zhengzhou，Henan，450002，China）

Abstract：A.phagocytophilumis a Gram-negative and obligate intracellular pathogen transmitted by ixodid ticks. This bacterium predominantly invades myeloid and nonmyeloid cells and causes tick-borne fever in animals and granulocytic anaplasmosis in humans.Here，we provided an overview on research of the related proteins involved in A.phagocytophiluminvasion into host cells，such as major surface protein MSP2，outer membrane protein OmpA，A.phagocytophilumsurface protein AipA.What's more，we also focused on the effects of A.phagocytophilumon host cells after its invasion and the underlying mechanisms.The influences such as activation of some protein kinases，downregulation of oxidative and inflammatory response，subversion of host apoptosis and autophagy were summarized in this paper.However，many scientific gaps about A.phagocytophilumare needed to fill currently.Fortunately，a large amount of researchers are focusing on howA.phagocytophiluminfluences cellular signal transduction and expressions of some related genes in neutrophils through investigating the interaction of the pathogen and the host cell to explore the underlying mechanisms that the bacterium can escape host immune system and survive in it.

Key words：A.phagocytophilum；host cell

作者简介：张 艳（1986-），女，河南邓州人，博士，主要从事嗜吞噬细胞无形体流行病学及致病机制研究。＊通讯作者

基金项目：国家现代肉羊产业技术体系建设专项（nycytx-39）

收稿日期：2014-09-10

中图分类号：S852.6

文献标识码：A

文章编号：1007-5038（2015）05-0095-04