小RNA 重组表达质粒转入猪体内环境释放安全性研究概况

寇建平，孙亚妮，赵 钦，周恩民＊

（1.农业部优质农产品开发服务中心，北京100020；2.西北农林科技大学动物医学院，农业部兽用药物与兽医生物技术陕西科学观测实验站，陕西杨凌712100）

RNA 干扰（RNA interference，RNAi）是指一种分子生物学上由双链RNA 诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。小RNA（microRNA，miRNA）能够识别特定的靶mRNA，通过降解或抑制mRNA，从而负调控靶基因的表达［1］。根据miRNA 前体分子结构特点而设计并合成的人工miRNA 也可以在体内通过与内源miRNA 相同或相似的途径发挥RNAi作用，目前人工miRNA 技术已成功的应用于调控基因表达以及抗病毒领域［2－5］。由于其在抗病毒领域的突出优势，目前以人工miRNA 介导的RNAi技术为基础的抗病转基因动物的研究具有广泛的发展应用前景［6］。然而随着人们对转基因动物及其产品的日益关注，其安全性也逐渐进入人们的视野，其核心问题集中于环境安全、动物健康与福利、人类健康与食品安全等方面。

非肌肉肌球蛋白重链Ⅱ－A 亚型（non－muscle myosin Ⅱ－A，NMHCⅡ－A）是与猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染有关的细胞蛋白之一。体外试验证实，通过RNAi技术敲低NMHCⅡ－A的表达可以降低PRRSV 在易感细胞内的增殖［7］。同时通过将构建的重组表达质粒pcDNA 6.2－miRNMHCⅡ－A 注射猪体内敲低肺脏巨噬细胞的NMHCⅡ－A 表达后，也可以部分抵抗PRRSV 的感染［8］。但是，pcDNA6.2－miRNMHCⅡ－A 作为一种外源性DNA 进入动物体后的环境安全性是其从实验室走向临床应用必须解决的一个关键性问题。因此，本研究着重综述了NMHCⅡ－A 人工miRNA 重组表达质粒转入猪体内之后，对环境安全的影响，为NMHCⅡ－A 人工miRNA 转基因猪的环境安全管理和可持续发展提供参考。

1 动物逃逸对环境的影响

转基因动物一旦逃逸到环境中，它对环境的潜在危害包括生物多样性的影响［9］、对其他动物生存的威胁［10］、传 播 疾 病［11］、打 破 生 态 平 衡［12］等 可 能性，但已有相关报道认为，转基因动物中昆虫逃逸的可能性是最大的，其次是鱼类，转基因家畜相对说逃逸的可能性最小［13］。就目前的研究水平来说，即使对于转基因昆虫和鱼类这样一些逃逸可能性最大的动物来说，也可通过物理、生理和生物等技术手段来综合控制。转基因鱼类尚且如此，那么转基因猪逃逸对环境的影响具有很高的可控性。我们对NMHCⅡ－A 人工miRNA 免疫和未免疫猪猪圈之间设立通道，允许被免疫猪“逃逸”到未免疫猪群中，发现被免疫猪并没有影响未免疫猪正常的生存和生长发育，并且猪圈的土壤、饮水和饲料中也没有转入基因的存在。所以退一步讲，即使NMHCⅡ－A 人工miRNA 免疫猪发生了逃逸，对于环境来讲也是安全的，更何况目前对于猪的养殖模式主要还是以规模化养殖和圈养为主，所以可通过物理等控制措施从源头上遏制其逃逸。

2 NMHCⅡ－A 人工miRNA 重组表达质粒转入猪体后通过基因水平转移方式对环境释放安全的影响

基 因 水 平 转 移 （horizontal gene transfer，HGT）是生物安全研究中很受关注的问题。HGT常见于微生物之间，植物和动物虽然发生HGT 的现象很少，但也存在HGT 的可能性，比如转基因动物有可能会通过肠道系统将外源基因转入肠道菌中；转基因动物在饲养过程中有可能会通过接触、交配、分娩和泌乳等行为产生HGT 现象。

2.1 通过排泄物发生HGT 可能性分析

转基因动物的排泄物是转基因动物对环境造成影响的直接因素之一。转基因动物中的外源基因有可能与动物自身肠道微生物发生基因交换重组，从而形成新的微生物群落，随着粪便和尿液排放到环境中，产生新的致病微生物危害人类健康和环境安全［14］。中国农业大学赵杰、许建香等已发现转基因猪和转基因牛的肠道和周围环境中均不会发生外源基因的HGT 现 象［14－16］。利用PCR－DGGE 联 合16 S rDNA 测序技术对NMHCⅡ－A 人工miRNA 免疫猪的肠道内微生物结构进行分析，并未发现外源基因水平转移到肠道菌，同时NMHCⅡ－A 人工miRNA 重组表达质粒pcDNA6.2－miRNMHCⅡ－A免疫猪后不同时间，粪便和尿液中均不含有外源基因，转入的NMHCⅡ－A 人工miRNA 重组表达质粒基因并没有发生HGT 而漂移到肠道菌，也没有随着排泄物排出体外。因此，NMHCⅡ－A 人工miRNA 免疫猪后，转入基因不会通过排泄物对环境安全造成威胁。

2.2 通过物理接触发生HGT 可能性分析

转基因动物在饲养过程中有可能会通过接触、交配等行为产生HGT 现象。NMHCⅡ－A 人工miRNA 重组表达质粒pcDNA6.2－miRNMHCⅡ－A基因是否会通过猪之间的物理接触发生HGT 也是我们所关心的问题之一。Wheeler M B等［17］已通过转基因猪实验证明转基因猪不会通过物理接触将外源基因转移到生活在同一环境中的非转基因猪中。pcDNA6.2－miRNMHCⅡ－A 免疫猪合群至未免疫猪群中，合群后不同时间，免疫猪和未免疫猪的口鼻分泌物和精液中、未免疫猪群的粪便、尿液、血液和内脏中均无转入基因的存在；而且未免疫猪的生长发育并未收到明显影响。因此，转NMHCⅡ－A 人工miRNA 猪同样也不会通过平时的物理接触而发生HGT 对周围健康非免疫猪产生不良影响。

3 NMHCⅡ－A 人工miRNA 基因在宿主体内的残留时间和分布

人工miRNA 转入动物体内之后，在动物体内的残留时间和组织分布也是威胁环境和其他物种安全的一个重要因素。已有的研究表明对于以肌肉注射方式免疫的动物，转入基因在短时间内会在注射部位和血液内有残留，但是一段时间后会逐渐消失，在其他组织器官均无分布。质粒在体内的停留时间与动物种属、代谢情况、免疫方法和次数具有相关性［18－21］。NMHCⅡ－A 人 工miRNA 重 组 表 达 质 粒pcDNA6.2－miRNMHCⅡ－A 以肌肉注射方式免疫猪24h 后，接种部位肌肉组织能检测到质粒的存在，而在其余组织的DNA 中均未检测出，这提示质粒在注射后数小时内还没有通过血液或淋巴循环分布到其他组织。在注射1d后，1头猪的注射部位肌肉和血液的基因组DNA 中检测出了质粒DNA 基因的存在，15d后，所有组织中都检测不到质粒的存在，说明质粒进入体内后经过一段时间后大部分会被代谢降解，而自始至终在被免疫猪的其他组织脏器中均未检测到转入基因的存在。

4 NMHCⅡ－A 人工miRNA 与宿主细胞基因组发生整合的可能性分析

重组表达质粒作为外源基因转入猪体内从实验室走向临床必须解决的另一个重要问题是用质粒DNA 免疫动物后是否会整合到宿主细胞基因组中［22］，对环境安全和人类健康造成威胁。重组表达质粒存在于动物体内有两种可能，一种是以游离质粒形式存在，另一种是重组表达质粒整合入宿主DNA 上。为消除染色体外游离质粒DNA 的污染，我们将制备好的免疫组猪的基因组DNA 进行纯化回收，然后对各组织定量后进行PCR 扩增。哺乳动物染色体组中的基因在不断地发生自发突变，只要其发生的频率对于每个基因来说不超过1×10－6，就不会对动物的遗传和健康造成影响［23］。本研究在免疫猪的所有组织脏器，包括注射部位肌肉组织的1μg基因组DNA 中未检测到重组表达质粒基因，这说明1μg基因组DNA 中存在质粒数量小于15.6个拷贝，如果所有质粒都整合入gDNA 上而产生突变，按哺乳动物基因组大小为3×109估算，1μg基因组DNA 约相当于1.6×105个细胞，按每个细胞有3×104个基因估算，导致的突变率约为2×10－9，相对于自发突变率2×10－6，仅为其千分之一［24］；此外，质粒DNA 和宿主DNA 可能是以插入和同源重组方式发生整合，但大量试验表明，有质粒DNA 以插入方式的概率极小，而同源重组整合双方必须有大于600bp高度同源的片段，所以发生外源DNA重组整合的可能性也是很低的。因此，可以认为在未经纯化处理的注射部位肌肉组织DNA 中检测到的pcDNA6.2－miRNMHCⅡ－A 基因是以游离质粒的方式存在于组织之内，而不是与猪的基因组发生整合。所以，NMHCⅡ－A 人工miRNA 重组表达质粒pcDNA6.2－miRNMHCⅡ－A 免疫猪，转入基因不可能整合入猪细胞的基因组中。

研究表明，将NMHCⅡ－A 人工miRNA 转入猪体内，可以通过利用针对NMHCⅡ－A 的miRNA 对NMHCⅡ－A 基因表达进行沉默，从而降低PRRSV在猪体内的增殖，提高猪抗PRRSV 感染的能力；同时NMHCⅡ－A 人工miRNA 转入猪体内之后，对于环境释放来讲是安全的，这就为利用NMHCⅡ－A人工miRNA 转基因猪技术培育抗PRRSV 猪新品种奠定基础和提供科学支持。

［1］ O′Donnell K A，Wentzel E A，Zeller K I，et al.c－Myc－regulated microRNAs modulate E2F1expression［J］.Nature，2005，435（7043）：839－843.

［2］ Bhomia M，Sharma A，Gayen M，et al.Artificial microRNAs can effectively inhibit replication of Venezuelan equine encephalitis virus［J］.Antiviral Res，2013，100（2）：429－434.

［3］ 谢佩雯，张秀娟，黄 海，等.利用人工miRNA 技术建立甲胎蛋白稳定沉默肝癌细胞及沉默效果评价［J］.医学综述，2013，19（10）：1865－1868.

［4］ 褚丽莎，韩 娜，宋向阳，等.诱导型eIF3g人工microRNA表达载体的构建及应用［J］.细胞与分子免疫学杂志，2011，27（2）：135－138.

［5］ Song H，Jiang C，Sun H.Construction and screening of the artificial miRNA plasmids targeting porcine Toll－like receptor 7 gene［J］.细胞与分子免疫学杂志，2013，29（1）：18－21.

［6］ 索朗拉姆.转基因技术提高动物生产性能的研究进展［J］.动物医学进展，2011，32（4）：103－107.

［7］ Zhou E M，Xiao Y，Shi Y，et al.Generation of internal image monoclonal anti－idiotypic antibodies against idiotypic antibodies to GP5antigen of porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］.J Virol Meth，2008，49（2）：300－308.

［8］ 高继明.非肌肉肌球蛋白重链Ⅱ－A 在PRRSV 感染细胞中的作用研究［D］.山东泰安：山东农业大学动物科技学院预防兽医系，2012.

［9］ Hone J.Feral pigs in Namadgi National Park，Australia：dynamic，impacts and management［J］.Biol Conserv，2002，105（2）：231－242.

［10］ Kapuscinski A R，Hallernan E M.Transgenic fish and publicpolicy－anticipating environmental impacts of transgenic fish［J］.Fisheries，1990，15（1）：2－11.

［11］ Tiedje J M，Colwell R K，Grossman Y L，et al.The planned introduction of genetically engineered organisms－ecological considerations and recommendations［J］.Ecology，1989，70（2）：298－315.

［12］ Pimm S L.The complexity and stability of ecosystems［J］.Nature，1984，307（5949）：321－326.

［13］ Muir W M，Howard R D.Assessment of possible ecological risks and hazards of transgenic fish with implications for other sexually reproducing organisms［J］.Transgenic Res，2002，11（2）：101－114.

［14］ Xu J X，Zhao J，Zhao Y F，et al.Molecular－based environmental risk assessment of three varieties of genetically engineered cows［J］.Transgenic Res，2011，20（5）：1043－1054.

［15］ Zhao J，Xu J X，Wang J W，et al.The environmental risk assessment of hLYZ transgenic pigs.Recent advances in animal genetic and breeding research－the 16th national annual conference for animal genetic and breeding［C］.Yangzhou：Chinese Association of Animal Science and Veterinary Medicine，2011.

［16］ Xin L L.Environment safety assessment of appA and MX1 cotransgenic pigs［D］.Beijing：Chinese Academy of Agricultural Sciences，2011.

［17］ Wheeler M B，Hurley W L，Mosley J，et al.Risk analysis of alpha－lactalbumin transgene transfer to non－transgenic control pigs during rearing，breeding，parturition and lactation［J］.Transgenic Res，2010，19（1）：136－137.

［18］ 靳彦文，钟 辉，马清钧.恶性疟原虫DNA 疫苗的安全性研究［C］.中国生物工程学会全国会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集，2001.

［19］ Margaret M，Morris－Downes，Kerry V，et al.Scmliki forest virus based vaccines：persistence，distribution and pathological analysis in two animal systems［J］.Vaccine，2001，19：1978－1988.

［20］ Suezanne E P.Particle－mediated nucleic acid immuniztion［J］.Human Gene Therapy，1999，10：741－758.

［21］ Terrie M.Immunostimulatory DNA immunization sequences necessary for effective introdemal gene［J］.Human Gene Therapy，1999，10：759－768.

［22］ Kurth R.Risk potential of the chromosomal insertion of foreign DNA［J］.Dev Biol Stand，1998，93：45－56.

［23］ Haworth R，Pilling A M.The PCR assay in the preclinical safety evaluation of nucleic acid medicines［J］.Hum Exp Toxicol，2000，9（5）：267－276.

［24］ Nichols W W，Ledwith B J，Manam S V，et al.Potentisl DNA vaccine integration into host cell genome［J］.Ann of Nei York Acad Sci，1995，772：30－39.