褪黑激素调控干细胞增殖与分化研究进展

黄婷婷，刘玉梅，张自强，张春燕，付文涛

（河南科技大学动物科技学院，河南洛阳471003）

褪黑激素（melatonin，MT），化学名N－乙酰基－5－甲氧基色氨（N－acetyl－5－methoxytryptamine）是以色氨酸为原料在松果体内合成的一种重要的吲哚类激素。20世纪50年代Lerner等从牛松果腺提取物中首次分离出能使青蛙皮肤褪色的物质，并命名为MT。此后一系列的研究证明，MT 合成之后进入血液和脑脊液而参与调控机体的昼夜节律、改善睡眠质量、抑制肿瘤生长［1］、提高抗氧化功能［2］、抗细胞凋亡等广泛的生物学效应。文献表明，MT 结合相应受体在细胞增殖与凋亡中发挥着重要的作用。有研究发现MT 能够选择性的与MT 1b和MT 1c受体结合并通过细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）及其下游转录因子κB（nuclear transcription factor kappa B，NF－κB）促进淋巴细胞的增殖［3］。谢有富等研究表明MT 可通过影响细胞周期蛋白E（cyclin E）、p53和Fas基因的表达，抑制增生性瘢痕成纤维细胞增殖并诱导该细胞凋亡。干细胞是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的原始未分化细胞，在适合的条件下或给予合适的信号，它能够向多种细胞分化。目前，干细胞在体外有效增殖和分化是其应用于临床的基本保障。但是有些干细胞体外增殖效率低，难以达到移植所需的数量。近年来，研究发现褪黑激素能够影响干细胞的生物学特性。本文综述MT 对干细胞的增殖与分化的最新研究进展，为干细胞有效的临床应用提供新参考。

1 褪黑激素的合成与分泌

MT 的合成与分泌具有明显的节律性，主要受外界环境和光线的控制，连续光照可以抑制MT 的释放，而黑暗条件下能够刺激MT 的分泌。光照信息刺激到视网膜产生神经冲动，经下丘脑视交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN）之后传递到颈上神经节（superior cervical ganglia，SCG）。然后通过SCG 将交感输入信息传递给松果体，经松果体转换为内分泌信息输出，交感神经末梢按照昼夜节律释放去甲肾上腺素。去甲肾上腺素与松果体细胞膜上的α－肾上腺素能受体或β－肾上腺素能受体结合，引起环核苷酶系统和5－羟色胺－N－乙酰转移酶活性的改变，进而影响MT 的合成和分泌［4－5］。人们已经在SCN，视网膜和松果体等中发现大量的MT 受体（MT1、MT2），并 且 还 发 现MT 受 体 的MT1 和MT2激活能够调节视网膜的功能，并将光信号传输到大脑，调控机体的昼夜节律和季节性活动。MT作为生物钟信号在SCN 中可以调节神经元的活动（MT1）控制信息的传输。

2 褪黑激素与胚胎干细胞

胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES）来源于哺乳动物的囊胚层，具有无限增殖、自我更新和多向分化的特性。研究证实ES细胞可在体外诱导分化为心肌细胞［6］、神经细胞、成骨细胞和肝细胞［7］等多种细胞类型。Yoo等研究MT 对胚胎干细胞（ESE14TG2a细胞系）转录因子表达的影响时发现，MT对ES细胞分化相关转录因子Oct4、REX－1、Sox2和Zfp206mRNA 的表达未见明显影响，但是MT（100 μmol／L）作用于ES－E14TG2a细胞24h后，细胞数量较对照组显著增多；且B 淋巴细胞瘤－2（B－cell lymphoma－2，Bcl－2）的表达显著升高，而Bax的表达受到抑制，从而证明MT 促进了ES－E14TG2a的增殖、抑制其凋亡。进一步通过Western blot方法证实，MT 促 进 了 丝 氨 酸 激 酶（set－inethreonine kinase，Akt）的磷酸化而抑制糖原合成激酶－3α／β（glycogen synthesis kinase－3α／β，GSK－3α／β）的活性，从而表明MT 影响ES－E14TG2a细胞增殖是通过激活磷 酯 酰 肌 醇－3－激 酶（phosphoinositide－3－kinase，PI3K／Akt）和β－链蛋白（β－catenin／Wnt）信号通路而实现［8］。Ashok等探讨MT 对初级ES细胞集落形成的影响，发现MT（0.5mmol／L）作用于ES 8d～12d时可显著增大细胞集落，并显著升高了Oct－4和Nanog的表达，从而证实MT 能够促使ES细胞增殖；促进初级ES 细胞的生长［9］。尽管有关MT影响ES细胞增殖与分化的文献数量有限，但是通过上述报道可确定MT 对ES细胞的增殖具有明显的调控作用。

3 褪黑激素与神经干细胞

MT 属于一种神经内分泌激素，它不仅通过血脑屏障（blood－brain barrier，BBB）进入中枢神经系统，还能当BBB 损坏时，通过松果体凹槽直接进入循环，从而影响神经细胞的发育。神经干细胞（neural stem cell，NSCs）是一种具有自我更新能力的成体干细胞，能够向神经元、星形胶质细胞［10］、少突胶质细胞［11］分化，但其增殖和分化受到环境、激素等多种因素调节。Fu J等［12］报道了MT 对缺氧条件下NSCs增殖的影响，发现100μmol／L的MT 不仅能够增加NSCs数量，而且该浓度下的MT 也能够促进缺氧微环境下NSCs的增殖。对其分子机制探讨后发现，缺氧微环境下NSCs MT 受体MT1 的mRNA 和蛋白质的表达量显著升高；丝裂原活化蛋白激酶（mitogen－activated protein kinase，MAPK）磷酸化的ERK1／2明显增强；加入MT 受体拮抗剂Luzindole后，ERK1／2 的磷酸化显著降低，最终证实MT 结合其受体MT1在缺氧条件下经过ERK1／2信号通路来调节神经干细胞的增殖。有学者从成年小鼠脑室下区获得NSCs并探讨不同浓度MT 对其增殖的影响，发现MT 处理后的NSCs获得的神经球数量增多，因而证明MT 可促进NSCs 的增殖［13］。Song J等［14］研究MT 对NSCs的保 护功能发现，在脂多糖诱导的炎性环境下，100nmol／L 的MT 能够抑制NSCs的凋亡，维持神经球的大小；且SOX2、TLX 和 成 纤 维 细 胞 生 长 因 子2 型 受 体（fibroblast growth factor receptor 2，FGFR－2）mRNA的表达显著增加，表明在脂多糖诱导的炎性条件下，MT 能够促进NSCs的增殖，抑制其凋亡。进一步研究了分子机制证实，脂多糖炎性微环境中MT 激活了PI3K／Akt／Nrf2信号，从而增加了NSCs的活性。MT 不仅影响NSCs的增殖，对其分化也有一定的 作用。Kong X Y 等［15］发 现，MT 能 够 提 高 酪氨酸羟化酶（多巴胺能神经元的标记物）的mRNA和蛋白表达水平；降低星形胶质细胞标志蛋白GFAP的表达，从而证实MT 能够诱导NSCs向多巴胺神经细胞分化而抑制星形胶质细胞的生成。由此可见，MT 对NSCs的增殖与分化具有十分重要的作用。因此，深入了解MT 对NSCs增殖与分化的作用机制并开展大量的临床试验，将会为神经退行性疾病的预防和治疗提供理论依据。

4 褪黑激素与脂肪间充质干细胞

脂肪间充质干细胞（adipose－derived stem cells，ADSCs）是从脂肪组织中分离出的一类间充质干细胞，不仅具有自我更新的能力，在特定的条件还可以向骨［16］、软骨［17］、心肌［18］等多种终末细胞分化。近几年报道ADSCs与MT 联合应用可以影响ADSCs的增殖与分化。Zaminy等研究MT 对ADSCs增殖与分化的影响发现，经MT（0.01 nmol／L～10 nmol／L）处理后，ADSCs的活性急剧减弱，细胞数量显著降低，表明MT 抑制了ADSCs的增殖，促进其凋亡。同时，将MT 与成骨诱导液混合作用ADSCs后发现，ADSCs内钙化结节的数量比对照组明显减少，且碱性磷酸酶的活性受到抑制，说明MT 抑制ADSCs向成骨细胞分化。表明MT 促进了ADSCs的凋亡，阻止了其向成骨细胞的分化［19］。陈嘉等［20］研究MT 对ADSCs向内皮细胞分化的影响，发现1.0μmol／L和0.1μmol／L 的MT 诱导ADSCs第8天时，血管性假血友病因子（von Willebrand factor，vWF）和血管内皮钙黏蛋白（VE－Cadherin，VE）的阳性表达率可达40%～50%，并且可形成血管管腔样结构，结果证明MT 可有效促进ADSCs向内皮细胞分化。试验中还发现细胞内钙离子浓度逐渐升高，p－ERK 蛋白表达显著增加，证实MT 通过增加细胞内钙离子的浓度，激活ERK／MAPK 信号通路促进ADSCs向内皮细胞分化。ADSCs具有来源广泛、取材方便等优势而且为避免免疫排斥可以实现自体移植，目前已成为组织工程中最理想的种子细胞之一，而ADSCs在体外有效的增殖和分化是其应用的前提和基础。分析以上报道可知，MT 不仅能够影响ADSCs的增殖而且可以调控ADSCs的分化。

5 褪黑激素与骨髓间充质干细胞

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是具有自我复制和多向分化潜能的成体干细胞，在特定的条件下能够向骨、软骨［21］、神经［22］等细胞分化。然而，BMSCs移植后在体内微环境中极易发生凋亡，影响了BMSCs修复组织损伤的效果。因此，提高植入BMSCs的存活率和降低凋亡率成为BMSCs临床应用的关键。Wang F W 等［23］研究了MT 对过氧化氢诱导的BMSCs凋亡的影响，发现MT（1、10、100nmol／L）预处理BMSCs 30min后，可有效抵抗过氧化氢诱导的凋亡，并证实MT 是通过抑制P38MAPK 信号途径发挥作用。最近有研究者报道了MT 在缺氧环境下对BMSCs增殖的影响，发现200nmol／L 的MT 不仅提高BMSCs 的活性，而且能够促进缺氧条件下BMSCs的增殖。对其分子机制进行深入研究发现，在缺氧微环境中，活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的产生受到抑制，Bax／Bcl－2蛋白表达率得到增加，线粒体膜电位减弱，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶－3（Caspase－3）被 激 活。由 此 证 明MT 经 由ERK1／2和p38信号通路促进移植的BMSCs存活，提高细胞生存能力［24］。

6 褪黑激素与牙髓干细胞

Gronthos等首次报道在人牙髓组织中存在干细胞即牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）。牙髓干细胞是继多种成体干细胞发现之后又一种能够向多种细胞分化的成体干细胞。研究已经证明DPSCs能够向神经［25］、脂肪、骨骼［26］等细胞分化。Cho等探讨MT 对DPSCs向肝细胞分化的影响，发现体外培养的DPSCs加入肝性诱导剂（hepatogenic medium，HM）培 养21d 时，添 加MT（0.1 μmol／L～10μmol／L）后，白蛋白（albumin，Alb）、细胞角蛋白18（cytokeratin 18，CK18）、C／EBPα 和 肝 细 胞 核 因 子（hepatocyte nuclear factor，HNF）的表达显著提高；DPSCs分化肝细胞的能力明显增强，表明MT能够促进HM 诱导DPSCs向肝细胞分化。对其作用机制探索发现，骨形态发生蛋白－2（bone morphogenetic protein 2，BMP－2）的表达增强，Smad1／5／8的表达受到抑制，进而证明MT通过BMP、p38、ERK和NF－κB信号通路实现调控DPSCs向肝细胞分化。同时，研究者利用CCL4建立体外肝纤维化模型，探讨MT 和DPSCs联合应用对肝纤维化的治疗作用。与对照组比较，MT和DPSCs联合移植入肝纤维化小鼠体内后，肝纤维化受到抑制，丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶和氨的水平得到恢复。进而证明MT 能够促进DPSCs治疗CCL4引起的肝纤维化［27］。目前，尚未发现MT 影响DPSCs增殖相关的报道，但是上述文献充分肯定了MT 能够调控DPSCs向肝细胞分化。由此，临床中应用DPSCs治疗肝脏相关的疾病时可以考虑MT在其中的作用。

7 结语

综上所述，MT 对ES细胞、NSCs、ADSCs、BMSCs和DPSCs增殖与分化具有重要的调控作用，其作用机制的复杂性越来越受研究者们的关注。今后需进一步探讨和研究MT 与干细胞联合应用的作用效果，发现和阐明MT 作用后的机制，为提高干细胞移植修复组织损伤提供参考。

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