新孢子虫抗原及疫苗研究进展

王 雪，孟庆峰，刘新欣，王 琪，姚贵哲，王伟利，＊

（1.吉林农业大学动物科技学院，吉林长春130118；2.吉林出入境检验检疫局，吉林长春130062）

新孢子虫是一种顶覆门专性细胞内寄生虫，最早由Bjerkas I等［1］在患脑膜炎和肌炎的幼犬中发现，由Dubey J P 等［2］命名为新孢子虫。新孢子虫可感染犬、牛、羊等多种温血动物，是引起母牛流产的主要原因，因此，新孢子虫病是一个兽医学上的严重问题，在经济学上也具有重要意义。新孢子虫感染宿主细胞主要包括黏附和入侵两个过程。在这个过程中，虫体内的细胞器及其所所分泌的抗原起到重要的重要。首先细胞表面因子暴露的瞬间引起新孢子虫微线体分泌相关蛋白，开始其黏附过程［3］，微线体蛋白与宿主细胞膜上的相应受体结合形成可以移动的连接区域，然后，棒状体分泌相关蛋白修饰宿主细胞，开始侵入细胞。在侵入的过程中，虫体形态不变，宿主细胞内陷形成纳虫空泡，使虫体居于其中，随后虫体棒状体蛋白、致密颗粒蛋白及一些其他因子对纳虫泡膜进行修饰，使其可以避免宿主细胞对纳虫泡的裂解作用。新孢子虫速殖子在纳虫空泡中进行繁殖2d～3d后，细胞破裂，新孢子虫速殖子进行下一轮的入侵。在此过程中，虫体表面抗原、棒状体蛋白、微线体蛋白、致密颗粒蛋白等都起着至关重要的作用［4］。新孢子虫入侵宿主细胞后，引起其细胞免疫反应及体液免疫反应。细胞免疫反应主要是新孢子虫的特异性抗原被抗原递呈细胞所识别并活T 细胞，使其中CD4＋T 淋巴细胞中的Th1 及Th2细胞分泌的细胞因子发生改变。新孢子虫的体液免疫主要是IgG 抗体水平发生改变，所以新孢子虫疫苗的研究主要是对新孢子虫特异性抗原引起细胞免疫反应及体液免疫反应进行评估［5］。

新孢子虫是引起世界范围内牛流产的主要原因之一，目前最有效的防治方法是通过对检测后确定感染及疑似患病的动物进行淘汰，建立无新孢子虫感染的牛群，但是处置造成的损失同样不可估量。因此，有必要建立一种有效的疫苗防止新孢子虫的传播。新孢子虫疫苗主要是抑制新孢子虫对宿主细胞的感染，并对宿主细胞提供一定的保护。现在已经研究的疫苗方法主要有灭活疫苗、弱毒疫苗、基因工程亚单位疫苗、基因疫苗、活载体疫苗等方面的研究并取得了很大突破。论文主要对新孢子虫在黏附入侵过程中分泌的抗原蛋白及根据其研制的疫苗进行概括。

1 新孢子虫抗原

1.1 虫体表面抗原

新孢子虫的虫体表面抗原主要有NcSAG1、Nc－SRS2、NcP0、p38、NcP29 和NcP40等蛋白［6］。Nc－SAG1与NcSRS2 是新孢子虫重要的虫体表面抗原，NcSAG1仅在速殖子阶段表达，NcSRS2在速殖子与缓殖子阶段均表达，它们在介导虫体入侵细胞中起到重要的作用［5］。NcSAG1与NcSRS2是免疫与检测试验中常用的抗原，它们具有较好的免疫原性，以其制备的重组疫苗可有效阻断新孢子虫对小鼠的入侵［7］。NcSAG4 在缓殖子阶段表达的蛋白，在新孢子虫感染细胞的周期中始终持续存在［8］。高建伟等人用P0基因制备DNA 疫苗，证明DNA 疫苗能够激起细胞免疫反应，具有很好的保护原性［11］。杨滨僮等人用PCR 方法扩增P40 基因，构建pET－28a－P40质粒并成功在大肠埃希菌Rosseta（DE3）中表达，证明了P40基因具有很好的免疫原性，可以作为疫苗的候选基因［9］。

1.2 致密颗粒抗原

致密颗粒蛋白GRA 在形成带虫空泡时起到重要的作用，目前已经被评价为候选抗原的有NcGRA1，NcGRA2，NcGRA6，NcGRA7 以及Nc－MAG1等［10］。贾立军等［11］用NcGRA7蛋白基因构建重组质粒pMD18－NcGRA7，并应用SDS－PAGE及Western blot方法对其进行分析，证明其具有很好的免疫原性，可以作为疫苗的候选基因。金春梅等［12］对NcGRA2t基因进行克隆测序，通过对其编码蛋白进行分析，说明其编码蛋白具有很强的抗原性，可以做为疫苗的候选基因。MAG1在虫体黏附细胞过程中具有一定的介导作用，焦石对其进行克隆分析，并用其与γ 干扰素基因融合，构建重组质粒，证明其具有一定的免疫原性，为其疫苗的研究提供一定的理论基础［13］。NcGRA14是长为1 215bp无内含子的基因，是新发现的一种致密颗粒蛋白，其免疫原性至今还没有确定［14］。

1.3 微线抗原

微线蛋白是由新孢子虫顶端的微线体分泌的一类蛋白，目前已知微线抗原蛋白主要有NcMIC1、NcMIC2、NcMIC3、NcMIC4及NcMIC10等。Yin J G 等［15］重组NcMIC10蛋白在大肠埃希菌中进行表达，并针对该蛋白的非重叠片段制备多克隆抗体，然后用ELISA 方法检测山羊血清中的抗体，对现有的抗原进行补充。AMA1是由微线分泌的顶膜抗原，是典型跨膜蛋白，在入侵对宿主细胞过程中具有一定的介导作用。郭焕平等［16］构建pMD18T－NcAMA 重组克隆质粒并克隆到腺病毒中，为以病毒为载体的新孢子虫重组疫苗提供依据。Srinivasan S以RIBI为佐剂，用重组NcMIC4蛋白免疫小鼠，可以引起体液免疫应答，IgG1 水平明显升高，同时减少新孢子虫对脑的感染性，NcMIC4 可以以作为疫苗的候选基因［17］。

1.4 棒状体抗原

棒状体蛋白在新孢子虫虫体入侵及对纳虫空泡进行修饰的过程中起到了重要作用。目前已知的棒状体 蛋 白 主 要 有NcROP1、NcROP2、NcROP3、NcROP4、NcROP8及NcROP30。现在研究比较多的是NcROP2 蛋白，也是确定的疫苗候选抗原之一。Debachea K 将NcROP2基因在大肠埃希菌中表达形成重组蛋白recNcROP2并与乳化的弗氏不完全佐剂接种到已经感染新孢子虫的小鼠体内，结果是接种重组蛋白的小鼠存活率比较高，其IgG 水平明显升高，说明其对新孢子虫具有一定的免疫作用［18］。新孢子虫的大部分基因都与弓形虫相似，有研究说明，棒状体蛋白可能与新孢子虫的毒力有关。Lei T 用弓形虫的TgROP18基因转染新孢子虫上，构建Nc1－TgROP18，然后对其毒力进行分析，转基因的新孢子虫比野生新孢子虫的毒力强，确定ROP18是弓形虫与新孢子虫毒力差异的关键因素［19］，并且可能与新孢子虫入侵宿主细胞并在宿主细胞内繁殖有关。

2 新孢子虫疫苗

2.1 灭活苗

灭活苗是指通过对虫体进行一定的处理使其失活，失去感染力和致病力，但保留其组成成分而制成的疫苗，具有安全性高、无毒力返祖现象等优点，但它不能激活细胞的免疫反应，并且在灭活过程中可能会导致一些保护性抗原缺失［5］。Andrianarivo A G 等［20］研 制 出 一 种 疫 苗，该 疫 苗 用Havlogen 和Polygen两种佐剂灭活新孢子虫的速殖子，Polygen能够引起机体较高的抗体水平，具有较好的免疫原性，但是Polygen是否对γ干扰素具有很强的刺激，目前还未明确，虽其不能预防妊娠奶牛的垂直传播，但通过静脉注射或肌肉注射能够达到一定的预防作用。Rojo－Montejoa S等用3种不同的佐剂灭活速殖子及3种不同虫体的数量来免疫小鼠，发现氢氧化铝与CpG 寡核苷酸的混合佐剂能够防止新孢子虫病慢性阶段，阻止新孢子虫在大脑中增值。而且研究表明了不同佐剂使疫苗的疗效发生变化［21］。

2.2 弱毒苗

弱毒苗又称弱毒活疫苗，是一种病原致病力减弱但仍具有活力的完整病原疫苗，也就是用人工致弱或自然筛选的弱毒株，经培养后制备的疫苗。此类疫苗可以刺激机体产生体液免疫应答和细胞免疫应答等多种保护性反应。Marugán－Hernández V等［22］应用Nc－1株的SAG4c1.1、转基因SAG4c2.1及野生Nc－1（WT）株制备活疫苗，并对已感染新孢子虫的怀孕小鼠进行免疫，小鼠病死率为40%、7%和5.6%，产后病死率分别为45%，11.1%和10.8%，证明了野生Nc－1（WT）株制备的弱毒苗对怀孕小鼠的免疫效果最好，也说明野生毒株的毒力弱。Rojo－Montejo S等［23］分离无毒力Nc－Spain 1H株，用5×105个活的Nc－Spain 1H 速殖子免疫小鼠，新生儿的病死率降低为2.4%，并激发Th1型免疫，将速殖子进行10倍稀释，低浓度速殖子可以引起IgG2a水平升高，高浓度速殖子能够引起IgG1升高，表明Nc－Spain 1H 能够防治新孢子虫病。但是目前还没有弱毒活疫苗可以用于预防新孢子虫的感染，一是因为弱毒苗依赖于体外细胞培养，需要大量的劳动力；二是已经用于预防牛流产的弱毒活疫苗，均导致了怀孕母牛流产，同时显示了活疫苗对孕畜具有一定的威胁。在此看来重组蛋白苗及亚单位疫苗对预防新孢子虫更具有吸引力和潜力［24］。

2.3 重组蛋白疫苗

重组蛋白疫苗是指将新孢子虫的目的抗原基因构建在表达载体上，将已构建的表达蛋白载体转化到细菌中，在一定的诱导条件下，表达出大量的抗原蛋白，通过纯化后制备的疫苗。Hecker Y P等［25］应用重组蛋白rNcSAG1、rNcHSP20和rNcGRA7 制备免疫刺激复合物并对感染新孢子虫的怀孕的母牛进行皮下注射，发现rNcSAG1，rNcHSP20 和rNcGRA7 具有一定的免疫原性，但是不能阻止新孢子虫的垂直传播。Lv Q 等人重组NcP78 和NcGRA7免疫蛋白并对Balb／c小鼠进行接种，发现重组的NcP78和NcGRA7能够引起Th1和Th2免疫应答，使IgG1和IgG2a抗体水平升高，此外，重组NcP78和NcGRA7可以减少新孢子虫在大脑的寄生及繁殖。虽然这些疫苗不能缓解人工流产的症状，但是可以增加后代的出生数量，对小鼠感染新孢子虫具有一定的保护作用［10］。

2.4 基因工程亚单位疫苗

基因工程亚单位疫苗是利用DNA 重组技术，将编码病原体的保护性抗原的基因导入原核细胞或真核细胞，使其在受体细胞中高效表达，分泌具有保护性的抗原肽链。新抱子虫亚单位疫苗是提取新袍子虫具有免疫原性的蛋白，加以佐剂制成的［9，26］。Otsuki T 等［27］证 明10 只 桑 蚕 能 够 表 达1.7 mg SAG1，17只桑蚕能表达370μg SRS2，表明桑蚕的表达系统能大量产生重组抗原应用于亚单位疫苗的制备。贾立军等［28］提取新孢子虫表面蛋白基因Nc－SAG1，进行原核表达，将经Western blot鉴定具有免疫活性的重组蛋白与弗氏佐剂混合制备NcSAG1基因工程亚单位疫苗，并免疫小鼠，检测抗体检的OD450nm 值为0.688；CD4＋／CD8＋T 细胞比值为3.650，均高于对照组，证明制备的基因工程亚单位疫苗具有一定的免疫效果。高建伟制备的新饱子虫3种不同佐剂亚单位疫苗按常规免疫程序免疫小鼠，测得3种佐剂亚单位疫苗的抗体效价及CD4＋T细胞均高于对照组，具有一定的保护作用［9］。

2.5 核酸疫苗

核酸疫苗分为两种，即DNA 疫苗和RNA 疫苗，它可被细胞吸纳，并在细胞内表达生成疫苗抗原。与传统疫苗相比，核酸疫苗具有特异性高、安全性好、制备简单等特点。核酸疫苗既可以诱导机体产生保护性抗体，同时也可以引起细胞免疫反应，特别是细胞T 淋巴细胞（cTL）反应。贾文影构建新袍子虫核糖体磷蛋白NcP0真核表达载体，转染Vero细胞，获得大量的pVAX1－NcP0质粒并添加佐剂免疫沙鼠，计算疫苗攻毒后pVAX1－NcP0 组和添加Cp－M 佐剂组的保护率分别为66.7%和70%，证明新孢子虫DNA 疫苗能够激活机体细胞及体液免疫反应，对新孢子虫病具有一定的预防作用［29］。

2.6 活载体疫苗

载体疫苗是用基因工程技术将保护性抗原基因（目的基因）转移到载体中使之表达的活疫苗。目前有多种理想的病毒载体，如痘病毒、腺病毒和疱疹病毒等都可以用于活载体疫苗的制备。郭焕平构建了含有AMA1基因的腺病毒载体疫苗及核酸疫苗，免疫Balb／c小鼠后腺病毒载体疫苗的IgG、IgGI及IgG2a均高于核酸疫苗，在一定程度上激活机体免疫反应［16］。贾立军以NcSRS2 基因构建重组腺病毒，免疫小鼠测抗体效价为1∶2 048，证实了Nc－SRS2重组腺病毒可以作为疫苗预防新孢子虫病的可行性［30］。

3 展望

新孢子虫疫苗的研究主要是对新孢子虫特异性抗原引起细胞免疫反应及体液免疫反应进行评估。综上所述，确定的可以作为疫苗候选基因的抗原蛋白主要有表面蛋白NcSAG1和NcSRS2；致密颗粒抗原蛋白NcGRA1、NcGRA2、NcGRA6、NcGRA7及NcMAG1；微线抗原蛋白NcMIC1、NcMIC3、Nc－MIC4、NcMIC10 和NcAMA1；棒 状 体 抗 原 蛋 白NcROP2等。

目前有大量的研究人员对新孢子虫特异性抗原进行筛选并用已知的试验方法测定其免疫原性的制备疫苗。现在研究比较广泛的主要有灭活苗、弱毒苗、基因工程亚单位疫苗、重组蛋白苗、核酸疫苗、活载体疫苗等。弱毒疫苗以及灭活疫苗是研究比较早的人疫苗，在一定程度上都有些不可忽视的缺点，因此在预防新孢子虫病上不是比较理想的选择。亚单位疫苗，重组蛋白疫苗以及核酸疫苗具有安全性高，稳定性强、制备简单、运输方便特点，在此看来可能比弱毒疫苗和灭活疫苗对预防新更具有开发力及潜力。活载体疫苗是现在一个研究热点，但是重复使用，可能使效果降低，还不是很理想，有待完善。虽然现在关于疫苗的研究有很多，但是还没有有效的疫苗被投入市场来预防新孢子虫病，但是相信随着不断深入的研究，在不久的将来，一定能够突破难点，最终成为控制新孢子虫病的重要手段

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