慢性中耳炎及胆脂瘤中细菌生物膜的观察

西安交通大学第二附属医院耳鼻咽喉头颈外科病院(西安710004)

王 冰 成 颖 许 珉▲

▲通讯作者

慢性中耳炎及胆脂瘤中细菌生物膜的观察

西安交通大学第二附属医院耳鼻咽喉头颈外科病院(西安710004)

王 冰 成 颖 许 珉▲

目的：通过扫描电子显微镜观察慢性化脓性中耳炎、分泌性中耳炎及中耳胆脂瘤中耳腔病变组织中细菌生物膜存在情况。方法：收集手术治疗慢性化脓性中耳炎11例,分泌性中耳炎8例,中耳胆脂瘤9例,术中中耳腔内病变组织为实验标本(其中肉芽组织11例、分泌液8例、胆脂瘤9例)；所得标本进行扫描电子显微镜观察其细菌生物膜存在情况。结果：肉芽组织、胆脂瘤中细菌生物膜检出率较高,分泌性中耳炎中稍低；近6个月有流脓病史者检出率低于近6个月无流脓病史者；胆脂瘤伴感染者检出率远高于不伴感染者。结论：细菌生物膜确存在于慢性化脓性中耳炎、中耳胆脂瘤，慢性分泌性中耳炎存在率相对较低；这可能是导致抗生素耐药、病情迁延不愈或反复急性发作的原因。

细菌生物膜(Bacterial biofilm,BF)是细菌自行集合的多细胞复合体，由细菌和自身及宿主共同分泌的细胞外多糖机制共同组成[1]，主要通过对抗机体免疫及产生抗生素耐药等机制导致慢性感染的迁延不愈或反复急性发作。目前认为99%的细菌以生物膜的形式存在，美国疾病控制与预防中心估计至少65%的人类细菌感染与生物膜有关[2]。在耳鼻咽喉相关疾病中,已有研究表明慢性扁桃体炎、腺样体炎、慢性鼻-鼻窦炎、中耳炎、胆脂瘤及耳科植入器械等均与细菌生物膜有关[3]。然而,而慢性化脓性中耳炎(CSOM)和慢性分泌性中耳炎(COME),中耳胆脂瘤,细菌生物膜研究较少。本实验通过扫描电子显微镜(SEM)对慢性中耳炎、胆脂瘤中耳腔中细菌生物膜的存在情况进行观察,了解其分布差异性。

对象与方法

1 对 象 慢性化脓性中耳炎11例，胆脂瘤9例，分泌性中耳炎8例，术中取鼓窦乳突腔或上鼓室病变组织(11例肉芽组织、9例胆脂瘤、8例分泌液)为实验标本。慢性化脓性中耳炎组根据近6月有无流脓病史分为两个亚组，胆脂瘤组根据是否伴发感染分为两个亚组。

2 方 法 术中所得标本立即置于2.5%戊二醛固定,依次用50%、70%、80%、90%、100%的乙醇浸泡,梯度脱水，每次5min,脱水后依次放入30%、50%、70%的醋酸异戊酯液中浸泡各10min,后置于100%醋酸异戊酯中20min充分置换,在体积分数100%二氧化碳气体中临界干燥1h,离子溅射表面固定镀膜,所得标本进行SEM观察。

3 扫描电镜结果判定 扫描电镜下同时观察到以下三个证据即认为存在细菌生物膜：①细菌大小及形态的物质；②连接于细菌球之间的不定形的多糖组织；③附着于组织表面[4]。

结 果

扫描电镜下,可见大面积聚集细菌及连接于细菌之间的纤维样组织(图1、4),即认为大量生物膜存在；如仅局部可见细菌及纤维样组织,或纤维样组织极其稀薄(图2、5),即认为存在少许细菌生物膜；如组织表面光滑(图3、7)或组织表面仅可见少许散在细菌无纤维样组织(图6、9)即认为无细菌生物膜存在。前两者均被认定为在组织中观察到细菌生物膜。

图1 扫描电镜下可见大量细菌聚集，有纤维样组织连接于细菌之间，箭头所指为纤维状物(2000×)；图2 扫描电镜下可见散在细菌生物膜，其余组织表面光滑(5000×)；图3 肉芽组织表面光滑，未见细菌或生物膜，箭头所指为肉芽组织(3000×)。

图4 扫描电镜下可见胆脂瘤表面大量细菌聚集，大量纤维样物连接于细菌之间，箭头所指为细菌(4000×)；图5 胆脂瘤表面可见少许纤维样物连接于细菌之间，箭头所指为纤维样物(1500×)；图6 胆脂瘤表面可见散在细菌分布，未见细菌生物膜，箭头所指为细菌，星号标记为胆脂瘤角化物(1000×)。

图7 分泌液表面可见大量纤维样物附着，其间可见细菌聚集，箭头所指为纤维物(2500×)；图8 可见散在细菌被细胞外多糖基质包裹，箭头所指为细胞外多糖基质(5000×)；图9 分泌液表面仅可见数个散在细菌，箭头所指为细菌(4000×)。

慢性化脓性中耳炎组11例中有8例观察到细菌生物膜，检出率8/11(72.7%)，胆脂瘤组9例6例观察到细菌生物膜，检出率6/9(66.7%)，分泌性中耳炎组8例中4例观察到细菌生物膜，检出率4/8(50%)。慢性化脓性中耳炎亚组中，近6月有流脓病史者8例中5例检出，检出率5/8(62.5%)；停止流脓超过6月者3例，均观察到大量细菌生物膜，检出率100%。胆脂瘤亚组中，胆脂瘤伴发感染者6例中5例观察到细菌生物膜，检出率5/6(83.3%)；胆脂瘤不伴感染者3例中仅1例观察到少许细菌生物膜，检出率1/3(33.3%)。(见附表)。

附表 不同类型中耳炎细菌生物膜检出率表

讨 论

本实验结果支持细菌生物膜在耳鼻咽喉疾病中发挥重要作用这一假设，我们的实验结果中，慢性化脓性中耳炎组11例中有8例观察到细菌生物膜，检出率8/11(72.7%)，胆脂瘤组9例6例观察到细菌生物膜，检出率6/9(66.7%)。这一结果与国外学者研究较为接近，Lee等[5]对CSOM患者中耳粘膜BF检出率为6/10(60%)；Chole等[6]发现胆脂瘤患者BF检出率为16/24(66.7%)，动物模型中胆脂瘤BF检出率为21/24(87.5%)；Kaya等[7]在其研究中发现CSOM的细菌生物膜存在率为7/10(70%)，胆脂瘤中存在率为8/13(61.5%)；Gu等[8]研究中发现CSOM细菌生物膜检出率92%，胆脂瘤组为85%。根据以上结果，有学者提出细菌生物膜可能是慢性中耳炎致病的重要因素之一，这可解释严重的抗生素耐药问题，Mah等[9]认为，处于细菌生物膜里层的细菌对环境变化多不敏感，尤其是对抗菌药物的敏感性显著降低。Schauder等[10]发现处于细菌生物膜内层的细菌对抗生素完全不敏感，这使感染反复发作，难以控制，同时长期低效度的抗生素环境使得内层菌变异而产生耐药性。而细菌生物膜与损伤部位的结合导致炎症迁延不愈。

慢性分泌性中耳炎组8例中4例观察到细菌生物膜，检出率4/8(50%)，而国外学者报道分泌性中耳炎患者中耳腔粘膜细菌生物膜检出率均较本实验结果高：Pinar等[11]在OME患儿中耳粘膜发现BF检出率为46/50(92%)；Hall-Stoodley等[12]在16例细菌培养阳性的OME中耳粘膜中BF检出率为9/16(56.3%)。出现实验结果差异较大可能与取材部位及检测手段有关。而在慢性化脓性中耳炎两个亚组中，停止流脓半年以上者3例中均观察到大量典型细菌生物膜，而近6个月有流脓病史者细菌生物膜检出率较低，Kaya等[7]发现CSOM检出率为70%而慢性非化脓性中耳炎检出率为54.5%；Akyildiz等[13]通过直接显微镜和透射显微镜观察中耳腔粘膜细菌生物膜，结果显示近期有耳漏症状组细菌生物膜存在率明显高于无耳漏组，而无耳漏组与对照组人工耳蜗移植组并无明显统计学意义。这一结果与本实验结果相差较大，考虑为本实验取材为炎症较重的肉芽组织，并且应用相对认可的扫描电子显微镜观察。本实验结果与BF的生物学行为一致。BF处于相对稳定状态时，病变组织内细菌以生物膜方式存在，疾病处于静止期，而当身体抵抗力下降或遭受外来感染时，生物膜这个三维立体的结构中细菌饱和，在密度感应系统及其他因素影响下，释放一部分细菌，形成感染的急性发作，浮游菌遇到适宜表面继续附着、发展、成熟，形成循环往复[14]。中耳胆脂瘤两个亚组中伴发感染组细菌生物膜检出率高，不伴发感染组仅1例观察到少许纤维样组织包裹细菌球，Saunders等[15]在其研究中也发现不伴发感染的胆脂瘤几乎未发现细菌生物膜，而伴发感染或急性发作的胆脂瘤细菌生物膜存在率极高，甚至鳞状上皮表面亦可观察到。

结论：我们的实验结果支持细菌生物膜存在于慢性化脓性中耳炎、中耳胆脂瘤及慢性分泌性中耳炎这一假设，认为细菌生物膜在不同类型的慢性中耳炎中存在较为普遍，而慢性分泌性中耳炎中细菌生物膜存在相对较低，这可能是导致抗生素耐药、病情迁延不愈或反复急性发作的原因。

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[15] Saunders J, Murray M, Alleman A. Biofilms in chronic suppurative otitis media and cholesteatoma: scanning electron microscopy findings[J].Am J Otolaryng,2011,32(1)：32-37.

(收稿：2014-09-28)

中耳炎 伴渗出液中耳炎 中耳炎,化脓性 胆脂瘤 细菌 生物膜 显微镜检查,电子

R764.21

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.02.007