miR-27在胃癌中的表达及其作用研究

西安交通大学医学院第一附属医院普外科(西安710061) 魏 疆 禄邵英

miR-27在胃癌中的表达及其作用研究

西安交通大学医学院第一附属医院普外科(西安710061) 魏 疆△禄邵英▲

目的：探讨胃癌组织中miR-27的表达情况及miR-27对胃癌细胞系MKN-45转移侵袭能力的影响，预测并验证miR-27的靶向基因。方法：选取16例胃癌组织及其对应癌旁正常胃黏膜组织，通过RT-PCR检测miR-27在胃癌中的表达情况，并分亚组比较有淋巴结转移组和无淋巴结转移组miR-27表达水平的差异；转染miR-27类似物(miR-27 mimics)或miR-27拮抗剂(miR-27 inhibits)及其NC对照后，用Transwell assay检测胃癌细胞系MKN-45转移侵袭能力的变化；用生物信息学软件预测miR-27的靶基因，并用RT-PCR及Western-blot验证miR-27对其靶基因表达和翻译的调节作用。结果：miR-27在胃癌组织中表达上调，有淋巴结转移组比无淋巴结转移组miR-27表达水平更高；转染miR-27 mimics后，胃癌细胞系MKN-45的转移侵袭能力增强，转染miR-27 inhibits后，胃癌细胞系MKN-45的转移侵袭能力减弱；PicTar、Targetscan和miRbase三个生物信息学软件同时预测出ZBTB10为miR-27的靶基因，RT-PCR检测显示：miR-27的表达对胃癌细胞中ZBTB10 mRNA的含量无影响，Western-blot检测显示：miR-27抑制胃癌细胞中ZBTB10蛋白的含量。结论：miR-27在胃癌中表达上调，促进胃癌细胞的转移侵袭，其机制可能与其抑制ZBTB10蛋白的翻译有关。

胃癌是一种全球范围的恶性肿瘤，其发病率在男性居第4位，在女性居第5位[1]。据统计[2]，2008年全球共增胃癌患者989600例，占所有新增肿瘤患者总人数的8%，其中因胃癌死亡738000例，占所有因肿瘤死亡患者总人数的10%。大部分胃癌患者确诊时已处于中晚期，常常伴随远处转移和淋巴结转移，此类患者即使经过手术治疗，5年生存率仍不足50%[3]。

MicroRNA是一类小分子非编码RNA，在转录后水平调节基因的表达，它们通过与mRNA互补性结合而抑制mRNA的翻译[4]。MicroRNA主要与mRNA的3’端非翻译区(3’UTR)结合而诱导mRNA的脱腺苷化和去稳定作用[5，6]。很多microRNA都被证实与肿瘤的转移有关，它们通过影响调控肿瘤转移的关键性基因的表达而发挥作用[7]。miR-27作为一个癌基因，其在胃癌中的具体作用机制尚未完全阐明。我们通过RT-PCR检测miR-27在16例胃癌标本组织中及其对应癌旁正常胃粘膜组织中的表达情况，并通过外源性促进或抑制miR-27在体外胃癌细胞系中的表达，观察其对胃癌细胞系转移侵袭能力的影响，最后通过生物信息学软件预测并通过RT-PCR及Western-bot验证miR-27的靶基因，以期阐明miR-27对胃癌的生物学作用及其潜在的分子机制。

材料与方法

1 研究材料 选取西安交通大学医学院第一附属医院普通外科手术切除的16例胃癌标本及其对应的癌旁正常胃黏膜组织，其中男9例，女7例，中位年龄53.7岁。16例胃癌标本中有8例合并淋巴结转移，8例无淋巴结转移。所有病例术前均为接受化疗及放疗，术后均经病理学诊断确诊。胃癌标本的取材部位为瘤体正中，癌旁正常胃黏膜组织的取材部位距瘤缘5cm以上，标本收集后置于-80℃冰箱保存。人胃癌细胞系MKN-45购自中科院上海细胞库。1640培养基购自购自美国Hyclone公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，Trizol试剂购自美国Ambion公司，逆转录试剂盒及RT-PCR试剂SYBR Green Real-time PCR Master Mix购自大连宝生物工程有限公司，转染试剂 Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司，miR-27 mimics/inhibits及其NC对照购自广州锐博生物科技有限公司，Transwell小室购自美国Corning公司，Matrigel基质胶购自美国BD公司，ZBTB10及β-actin抗体均购自美国Santa cruze公司。所有引物均委托上海生工生物有限公司设计并合成。

2 细胞培养及转染 人胃癌细胞系MKN-45使用含10%胎牛血清、100U/ML青霉素及100U/ML链霉素的1640培养基，在37℃、5%CO2饱和湿度及条件下培养，每周换页2～3次。细胞生长至70%后使用0.25%胰蛋白酶消化并传代。实验将胃癌细胞分为3组：miR-27 mimics组、miR-27 inhibits组、NC对照组，细胞接种于6孔板中待融合度为50%时按Lipo 2000说明书分别转染。

3 RT-PCR 以Trizol-氯仿-异丙醇法抽提组织和细胞系中总RNA，NanoDrop 2000定量，根据反转录试剂盒操作说明获取RT液。引物列表如附表所示，反应条件为: 预变性95℃ 3 min，95℃ 10 s，55℃ 30 s，40个循环，每组设置3个复孔，实验重复3次。

4 Western-blot 用5%浓缩胶、12%分离胶进行SDS-PAGE电泳，开始时70V恒压约30min，待溴酚蓝进入分离胶后改用120V恒压约2h。用Bio-Rad半干电转仪120mA转移30min，将蛋白转至硝酸纤维素膜。取出NC膜，洗涤后用含5%脱脂奶粉封闭液封闭1h。用含5%脱脂奶粉的PBST稀释抗HA一抗(1∶2000)室温孵育2h。用含5%脱脂奶粉的PBST稀释羊抗鼠二抗(1∶2000)室温孵育1h。发光底物孵育2min后曝光、显影、定影。应用ChemiImage 5500自动电泳凝胶成像分析仪照相。

附表 引物列表

5 Transwell assay Matrigel置于4℃冰箱融化过夜，铺胶操作在冰上进行，Matrigel基质胶与纯1640培养基以1∶4的比例稀释后18μl/孔铺于Transwell小室正面，至于37℃干燥4h备用。常规消化离心细胞并计数后用含0.5%血清的1640培养基调整细胞密度使每200μl体系中含2.5× 104个细胞。使用前提前30min用无血清1640培养基在37℃水化凝固的Matrigel胶，接种细胞前吸走水化的1640培养基，200μl/孔细胞悬液接种于小室上层，小室下层每孔加入1ml含10%血清的1640培养基，37℃培养24h。用棉签擦去小室上层未穿透的细胞，注意动作轻柔勿损坏小室滤膜，PBS冲洗小室两遍，室温晾干约10min。2ml/孔甲醇固定小室背面细胞约15min，捞出小室倒置晾干15min。80μl/孔0.09%结晶紫滴于小室背面染色约5min，用自来水小心冲洗小室侧面，洗去结晶紫染液，室温晾干后倒置显微镜小下观察细胞穿透情况，选取视野拍照。

6 统计学方法 所有计量资料的数据均以均数±标准差表示，采用SSPS13.0统计软件包对数据进行处理，实验数据采用t检验进行统计学分析，以P<0.05为有显著性差异，P<0.01为有极显著性差异。

结 果

1 miR-27在胃癌组织中的表达 我们用RT-PCR检测了16例胃癌组织及其对应的癌旁正常胃黏膜组织中miR-27的表达水平。结果显示：与正常胃黏膜组织相比，miR-27在胃癌组织中的表达水平显著上调(见图1)。MiR-27在胃癌组织中的表达水平为6.034±0.270，在正常胃黏膜组织中的表达水平为2.244±0.226，配对t检验结果提示t=11.91，df=15，P<0.01，说明miR-27在胃癌组织和正常胃黏膜组织中的表达水平具有显著性差异。随后我们根据这16例胃癌有无淋巴结转移将其分为两组，每组8例，对这两组之间的miR-27表达水平进行比较。结果显示：有淋巴结转移组的miR-27表达水平为6.810±0.229，无淋巴结转移组的miR-27表达水平为5.26±0.296，成组t检验结果提示t=4.15，df=14，P=0.001，说明有淋巴结转移组的胃癌组织中miR-27的表达水平高于无淋巴结转移组，两者有显著差异(见图2)。

图 1 miR-27在胃癌组织中的表达

2 miR-27对胃癌细胞系转移侵袭能力的影响 为了验证miR-27对胃癌细胞系转移侵袭能力的影响，我们选择人胃癌MKN-45细胞系作为研究对象，分别将miR-27 类似物(miR-27 mimics)和miR-27拮抗剂(miR-27 inhibits)转染至MKN-45细胞系中，转染24h后用RT-PCR验证miR-27类似物和拮抗剂的转染效率，并用Transwell assay验证miR-27对MLN-45转移侵袭能力的影响。MiR-27转染效果如图所示(见图3～4)结果显示：miR-27对胃癌细胞系MKN-45的转移侵袭能力具有促进作用，转染了miR-27类似物的MKN-45，其转移侵袭能力增强(见图5)；而转染了miR-27拮抗剂的MKN-45细胞系，其转移侵袭能力显著减弱(见图 6)。

图2 淋巴结转移与miR-27表达的关系

图3 miR-27类似物的转染效率

图4 miR-27拮抗剂的转染效率

图5 转染miR-27类似物后MKN-45转移侵袭能力的变化

图6 转染miR-27拮抗剂后MKN-45转移侵袭能力的变化

3 miR-27靶基因的预测及验证 MicroRNA通过与其靶基因mRNA的3’非翻译区(3’ UTR)互补而在转录后水平抑制靶基因mRNA的翻译。为了进一步探究miR-27对胃癌转移侵袭促进作用的生物学机制，我们用PicTar、Targetscan、miRbase三个生物信息学软件预测了miR-27的潜在靶基因，三个生物信息学软件的预测结果均提示ZBTB10基因为miR-27的靶向基因。ZBTB10基因是锌指蛋白家族的主要成员之一，与肿瘤的上皮间质转化(EMT)及转移侵袭密切相关。为了进一步验证miR-27对ZBTB10的抑制作用，我们用RT-PCR和Western-blot检测了转染miR-27类似物及抑制剂后MKN-45中ZBTB10的表达水平。RT-PCR结果显示：miR-27类似物和拮抗剂转染前后，MKN-45中ZBTB10基因的表达水平无显著性差异(P>0.05)。MiR-27类似物转染组的ZBTB10 mRNA表达水平为1.230±0.292，miR-27拮抗剂转染组的ZBTB10 mRNA表达水平为1.190±0.194，阴性对照组的ZBTB10 mRNA表达水平为1.380±0.196，miR-27类似物和阴性对照组之间t检验的P=0.704，miR-27拮抗剂和阴性对照组之间t检验的P=0.535，说明ZBTB10基因的表达水平在miR-27类似物和阴性对照组之间及miR-27拮抗剂和阴性对照组之间无显著性差异(P>0.05)。Westren-blot结果显示：miR-27类似物和拮抗剂转染前后，MKN-45中ZBTB10蛋白的含量存在显著差异(P<0.05)。转染miR-27类似物后，MKN-45中ZBTB10蛋白的含量显著降低，而转染miR-27拮抗剂后，MKN-45中ZBTB10蛋白的含量显著升高(P<0.05)。以上实验结果提示：在胃癌细胞系MKN-45中，ZBTB10为miR-27的靶向基因，miR-27通过抑制ZBTB10 mRNA的翻译来促进胃癌细胞的转移侵袭作用，而对ZBTB10的表达无明显影响(见图7～8)。

图7 miR-27对ZBTB10表达的影响

讨 论

MicroRNA是一类约23个核苷酸长度的小分子非编码RNA，它们通过抑制mRNA的翻译而在转录后水平调节基因的表达。MicroRNA对mRNA的转录后抑制是通过microRNA种子区和mRNA3’端非翻译区的碱基互补配对来完成的[4]。MicroRNA主要通过mRNA3’端非翻译区的互补序列来识别目标mRNA。然而，近期一些研究表明：microRNA也可以与目标mRNA的5’端非翻译区和开放阅读框结合[8]。当microRNA和目标mRNA结合后，microRNA通过脱腺苷化和去稳定作用来抑制目标mRNA的翻译。MicroRNA与目标mRNA的互补程度决定了microRNA的功能。如果microRNA和目标mRNA不完全互补，microRNA的功能通过抑制目标mRNA翻译来实现，如果microRNA和目标mRNA完全互补，则microRNA的功能将通过降解目标mRNA来实现[9]。

图8 miR-27对ZBTB10翻译的影响

很多microRNA均被证实与胃癌的转移有着密切的关系，它们参与胃癌转移的各个方面的调控，包括上皮间质转化、失巢凋亡、血管生成、迁移和侵袭等[10]。MiR-27，作为一个癌基因，在肿瘤组织中往往过表达，促进肿瘤发生发展的各个方面。崔秀英等研究指出：miR-27在乳腺癌组织中高表达可能与乳腺癌的恶性程度及预后有关,有可能成为乳腺癌新的预后指标及治疗靶点[11]。MiR-27还可能通过调控FOXO1表达在肾癌中起致癌作用[12]。对胃癌患者外周血的分析显示：miR-27在胃癌患者的外周血中含量明显升高，可作为胃癌的良好预后指标[13]。

我们对16例胃癌标本组织及其对应的癌旁组织中miR-27的表达进行了检测，结果显示：miR-27在胃癌组织中表达较癌旁组织高，并且miR-27过表达的水平与淋巴结转移相关，伴有淋巴结转移的胃癌组织中miR-27的表达水平高于无淋巴结转移的胃癌组织，说明miR-27作为癌基因在胃癌中过表达，其具有促进胃癌转移侵袭的作用，这一作用也得到了体外细胞实验的验证。在胃癌细胞系MKN-45中外源性过表达miR-27后，其转移侵袭能力增强，而外源性抑制miR-27的表达后，其转移侵袭能力减弱。生物信息学软件预测ZBTB10为miR-27的靶基因，我们用RT-PCR和Western-blot检测了miR-27对ZBTB10基因表达和翻译的影响。结果显示：miR-27能抑制ZBTB10 mRNA的翻译，而对ZBTB10基因的表达无影响。以上结果说明miR-27在胃癌中过表达，对胃癌的转移侵袭具有促进作用那个，其作用可能通过抑制ZBTB10 mRNA的翻译而实现。

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(收稿：2014-09-20)

胃肿瘤/病理生理学 癌基因/代谢 @ miR-27

R735.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.05.046

△进修医师：陕西省镇巴县人民医院外一科

▲通讯作者