鸡新城疫免疫胶体金诊断技术

摘要：鸡新城疫是由新城疫病毒引起的、具有高度感染性和致死性的疾病。这种病毒主要通过病鸡的脑、血液、粪便、内脏和口鼻传播，侵害鸡的呼吸道、胃肠道和中枢神经系统。目前国内外对鸡新城疫不能很好地控制病毒的传播和蔓延。胶体金诊断技术是用于对鸡新城疫的检测技术，本文主要从胶体金诊断技术的材料与方法、结果与诊断等方面进行阐述。

鸡新城疫是侵害鸡和火鸡的主要疾病之一，它是一种急性传染病，对养禽业的危害很大。目前实验室对该病的诊断技术主要有3种，即血凝抑制试验（HI）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和聚合酶链式反应（PCR） [1]。然而，血凝抑制试验不敏感、检测的样本数量比较少、不同实验室检测出的结果会有很大差异，而且受人为因素的影响较大。其他几种方法操作起来比较麻烦，而且技术含量比较高，无法大面积或者在基层推广，因而建立一种简便快捷、操作性强的诊断技术势在必行，这种技术就是胶体金诊断技术。

胶体金是一种依靠静电排斥作用来维持自身稳定的胶体体系，吸附作用强，其颗粒是单个存在的带负电荷的疏水胶，必须被大分子包裹起来才能在电解质中稳定存在，而且它可以同糖蛋白、毒素、抗生素、酶及激素等物质的非蛋白质进行结合，因而可以作为免疫反应的标记。用蛋白质标记胶体金，方法简便快捷，试剂性能好，反应时间短，结果用肉眼即可鉴定。

1　材料

疫苗为新城疫Ι系疫苗和新城疫Lasota毒株；实验动物为病鸡（非免疫）、土鸡和家兔（健康）；药品为氯化金、葡萄糖凝胶、硝酸纤维素膜、去离子水、牛血清蛋白、玻璃纤维、柠檬酸钠、聚乙二醇和透析袋。

2　方法

（1）IgG的分离与提纯。IgG的提取采用盐析法，将50mL鸡血清与50mL生理盐水混合，缓慢加入到100mL35%硫酸铵溶液，并不断搅拌，在4℃冰箱中过夜，然后离心弃去上清液。将沉淀物再次进行悬浮与离心洗涤。沉淀物在缓冲液中透析、除盐，直到将硫酸除尽，获得粗提纯。将泡好的葡萄糖凝胶与缓冲液进行平衡，然后将其装在长25cm、半径1cm的层析柱中。1小时后待多余液体流出来再加样，用少量缓冲液清洗管壁内侧，流出大约20mL的洗脱液时用20%磺基水杨酸进行检测，收集所需蛋白质并用蔗糖浓缩。

（2）抗体制备。将2月龄以上的鸡用鸡新城疫Ι系疫苗进行免疫，2周以后再次免疫。10天后进行试血，如果达到理想标准则进行心脏采血与血清分离，采集到的即为鸡新城疫抗体。用盐析法进行初步提纯，然后用离子交换柱法进一步提纯。将提纯后的抗体在PEG-20000透析袋内浓缩，并对蛋白质浓度进行测试且调为1mg/mL，检测抗体效价并进行冷冻保存。

将制得的鸡新城疫抗体制成弗氏完全佐剂对家兔进行初次免疫，1个月以后再用弗氏不完全佐剂进行免疫，10天后进行试血，达到预期的效果后对其进行心脏采血与血清分离。用盐析法进行初步提纯，然后用离子交换柱法进一步提纯，将提纯后的抗体在PEG-20000透析袋内浓缩，并对蛋白质浓度进行测试且调为1mg/mL，检测抗体的效价并进行冷冻保存。

（3）胶体金的制备。胶体金的制备采用柠檬酸钠还原法。首先用去离子水配置氯化金溶液，配置的比例为0.01%。取100mL配置好的氯化金溶液进行加热，加热至沸腾时快速搅拌，在搅拌剧烈的情况下将配置好的柠檬酸钠溶液迅速加入，继续加热至沸腾，5~8分钟后溶液变为酒红色。用去离子水将溶液调为直径约20nm的胶体金颗粒溶液，并在4℃下保存。

（4）胶体金标记物的制备。取20mL胶体金颗粒溶液，用碳酸钾溶液将pH调至9.0~9.2，在磁力的搅拌下慢慢加入0.4mL纯化的一抗，搅拌20分钟以后加入0.8mL聚乙二醇溶液，再加入0.4mL稳定剂以防止发生非特异性凝聚。搅拌均匀后高速离心弃去上清液，将得到的沉淀物-胶体金蛋白质结合物放入PBS中，制成包裹着蛋白质的胶体金溶液，冷藏保存 [2]。

（5）胶体金试纸条的制备。将配置好的胶体金标记均匀涂在玻璃纤维上，干燥后冷冻保存。

将一抗和二抗用pH7.5的PBS溶液稀释，包裹在硝酸纤维素膜上，线的宽度保持在1nm左右，两条线之间的距离控制在0.5cm。鸡新城疫抗体线作为检测线，兔抗鸡抗体线作为质控线，干燥以后用含1%BSA 的PBS进行封闭，保存备用。

3　结语

胶体金诊断技术作为一种检测鸡新城疫的手段，具有可推广性强及操作简便快捷的优点。胶体金的制备方法有很多，但是单一粒度胶体金颗粒的制备通常采用柠檬酸钠还原法，使用这种方法制备效果更好。