RP-HPLC法同时测定成人血清中苦参素和阿德福韦酯的浓度方法学研究

陈 纭，黄晓晖，吴婷妮，魏丽华，杨海婷，刘真真，李 冬，李琳琳，潘 亭

(安徽医科大学药学院，安徽合肥 230032)

据流行病学调查，我国现有乙型肝炎病毒携带者约1．2亿，有3 000多万慢性乙型肝炎患者［1]，因此，慢性乙型肝炎的预防、诊断和治疗是乙型肝炎防治的重要课题和研究热点。临床研究发现，抗病毒治疗乙型肝炎是减少和降低肝硬化和肝癌发生的关键［2]。苦参素是从豆科植物苦豆子及苦参中提取分离的生物碱。临床研究表明，苦参素有抗癌、抗病毒、抗炎、调节机体免疫、抗心律失常等作用，主要用于治疗慢性乙型肝炎及放、化疗引起的白细胞减少等［3]，且相对于苦参碱，苦参素毒性更低［4]。阿德福韦酯是新型核苷类抗乙型肝炎病毒药物，国外临床研究资料表明，阿德福韦酯能有效地抑制HBV DNA的复制，使HBV DNA滴度迅速降低，阿德福韦酯虽起效慢，但耐药率低、持续应答率高，阿德福韦酯不仅是抗HBV的首选药物，也常用于拉米夫定耐药的挽救治疗［5]。研究表明，阿德福韦酯联合苦参素治疗慢性乙型肝炎疗效较单用阿德福韦酯疗效显著［6]。苦参素和阿德福韦酯临床联用治疗乙肝患者，可以提高阿德福韦酯抗病毒疗效，能够有效抑制HBV DNA的复制，控制疗效显著［7]。对于乙肝的患者，我们应该定期监测联用这两种药的血药浓度，确保其用药安全性。本文首次采用RP-HPLC法，建立联合治疗乙肝患者血清中苦参素和阿德福韦酯血药浓度检测方法，便于这两种药物的临床血药浓度监测，国内外无相关文献报道。

1 实验仪器与试药

岛津高效液相色谱仪(包括LC-20ATvp溶剂输送泵，Rheodyne 7725i手动进样阀，SPD-M 20A紫外—可见检测器，LC-Solution色谱数据工作站等);Neofuge23R台式高速冷冻离心机(力康发展有限公司);超纯水机(美国Millipore ROIS5 30L TANK);DL-360A超声波脱气机;电子天平(型号:BLXKJA3003B)等。苦参素对照品(温州市华基化工有限公司，批号:201301);阿德福韦酯对照品(北京奇松生物科技有限公司，批号:201302);甲醇为HPLC专用色谱纯，水为二次蒸馏水;标准空白人血清由中国食品药品检定研究院提供。

2 方法

2．1 色谱条件 色谱柱为Shim-pack VP-ODS C18色谱柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm);流动相:甲醇—水(70∶30);流速:1．1 mL·min－1，检测波长:229 nm，柱温:40℃。

2．2 对照溶液的配制 精密称定苦参素和阿德福韦酯标准品各10 mg，用甲醇配制苦参素100 mg·L－1阿德福韦酯 100 mg·L－1的对照品贮备液;分别取适量贮备液，用甲醇精密稀释成2 mg·L－1的苦参素和1 mg·L－1阿德福韦酯的标准溶液，放在冰箱冷藏贮存待用。

2．3 血样处理 取标准空白人血清100μL，加入2 mg·L－1苦参素标准溶液100 μL 和1 mg·L－1阿德福韦酯的样品标准液各100μL，加100μL甲醇，漩涡混匀，8 000 r·min－1，4℃离心 10 min，取 20 μL进样。

2．4 方法专属性考察 分别取空白血清、标准品溶液、样品血清20μL进样，色谱图(图1)中苦参素保留时间为4．6 min左右，阿德福韦酯的保留时间为7．3 min左右，两药能完全分离且无杂质峰干扰。

2．5标准曲线的制备 取空白试管，先加入血清1 mL，再分别加入一定量的苦参素和阿德福韦酯标准品溶液，配成苦参素浓度为 0．012 5、0．025、0．05、0．1、0．5、1、2 mg· L－1及阿德福韦酯浓度为0．012 5、0．025、0．062 5、0．125、0．25、0．5、0．75 mg·L－1的系列混合血样，按上述2．3项下方法进行操作，各进样20μL，以峰面积(Y)为纵坐标，浓度(X)为横坐标，得苦参素和阿德福韦酯的回归方程，苦参素为 Y=4．2 ×105X+54 906(r2=0．999 2)，阿德福韦酯为 Y=1．8 ×105X+2 528．4(r2=0．999 1)。结果表明苦参素和阿德福韦酯血药浓度分别在0．012 5 ～2 mg·L－1、0．012 5 ～0．75 mg·L－1范围内线性关系良好。另取标准品溶液经水稀释后按信噪比大于3的要求试验，结果苦参素和阿德福韦酯的最低检测限分别为0．003 mg·L－1和0．002 mg·L－1(图2)。

2．6 回收率试验 分别准确称取苦参素和阿德福韦酯标准品适量，置于100 mL容量瓶中，配制成含苦参素低、中、高 3 种浓度为 0．025、0．1、1 mg·L－1和阿德福韦酯低、中、高 3种浓度为 0．025、0．125、0．5 mg·L－1的模拟样品溶液9份，每个浓度各3份，加入到1 mL血清中。

均按2．3项下方法进行操作后进样，各取20μL进样，并计算回收率(结果见表1)。由表1可见，低、中、高浓度苦参素回收率均在92%以上，该法的提取回收率良好。

2．7 精密度 取空白试管分别加入不同量的标准品溶液，加入1 mL血清，使苦参素血清药物浓度分别为0．025、0．1、1 mg·L－1，使阿德福韦酯血清药物浓度分别为 0．025、0．125、0．5 mg·L－1。按2．3项下方法操作，计算日内变异和3 d内日间变异(见表2)。

表1 血清中苦参素和阿德福韦酯回收率的测定结果(n=5)

表2 苦参素和阿德福韦酯精密度结果(n=5)

2．8 稳定性试验 在空白血清中分别加入适量的苦参素和阿德福韦酯标准溶液，配置成苦参素和阿德福韦酯的浓度分别为0．100 mg·L－1的血浆样品，分别于 0、2、4、6、12、24 h 时各取 1 mL，然后按 2．3项下方法操作，各取20μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果苦参素和阿德福韦酯的RSD分别为5．8%、3．6%，表明苦参素和阿德福韦酯的血浆样品至少在24 h内稳定。

3 讨论

3．1 检测波长的选择 在波长选取时，苦参素和阿德福韦酯标准溶液在210～380 nm波长范围内进行光谱扫描，结果发现，苦参素在229 nm波长处有最大吸收，阿德福韦酯在260 nm波长处有较大吸收，考虑229 nm阿德福韦酯吸收也较好，选择229 nm作为此次试验检测波长。

3．2 流动相的优化选择 参考文献［8]，经预试验确定甲醇∶水(70∶30)为流动相优于其它流动相系统，苦参素与阿德福韦酯在此系统能够很好分离，且不受其他峰干扰，并且二者的保留时间均小于10 min，可以同时测定人血清中苦参素与阿德福韦酯浓度。

3．3 血样提取条件的选择 本实验血清样品的前处理方法采用了甲醇蛋白沉淀法提取，乙醚和二氯甲烷的液液萃取法，综合比较回收率，成本等因素，最终采用甲醇蛋白沉淀法，该方法药物的回收率较高，减少了样品处理的所需时间和工作量，而且降低了样品处理的成本。

综上所述，本实验研究表明该法线性关系好，回收率高，操作简单快速，在国内为同时监测人血清中苦参素和阿德福韦酯的浓度提供了简便可行的方法，还可以用于药物代谢动力学研究。本实验采用反相高效液相色谱—紫外检测法(HPLC-UV)测定健康成人血浆样品中苦参素和阿德福韦酯的药物浓度，并探索和改进方法，从而为同时监测联合用药下人体药物代谢动力学研究进一步提供方法学参考。实际样本测定的相关研究将在我院继续进行。

［1] 张凤英，李 琼，邱国华，等．阿德福韦酯联合苦参素胶囊治疗乙型肝炎肝硬化疗效观察［J/CD]．中华实验和临床感染病杂志(电子版)，2012，6(1):49 －51．

［2] 杨玲燕，毛鸿琴．慢性乙肝患者核苷酸治疗依从性的影响因素及护理干预［J]．河北联合大学学报(医学版)，2012，14(2):255－256．

［3] 陈海燕，郭鸿雁，冷晓红．HPLC法测定西北地区不同产地苦豆子药材中生物碱的含量［J]．北方药学，2013，10(5):10 －11．

［4] 宋 兵，韩崇选，张宏利．3种苦参生物碱对小鼠的毒性作用研究［J]．西北植物学报，2009，29(4):818 －823．

［5] 白连伟，高有方，王兴民，等．拉米夫定与阿德福韦酯联合治疗E抗原阳性乙型肝炎肝硬化代偿期患者的疗效观察［J]．安徽医药，2013，17(5):841 －842．

［6] 徐治国，梁 艳．阿德福韦酯联合苦参素治疗慢性乙型肝炎患者的临床研究［J]．中外医学研究，2013，11(3):22 －23．

［7] 杨 琦，赵靖松，杨 凯．阿德福韦酯联合苦参素治疗慢性乙型肝炎［J]．临床医学，2011，31(9):48 －49．

［8] 马玉蓉．反相高效液相色谱法测定阿德福韦酯片的含量［J]．中国药业，2013，22(15):51 －52．