HPLC法同时测定痛经贴剂中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量

张丽君，田 军，刘 永

(1．安徽中医药大学，安徽合肥 230012;

2．安徽省食品药品检验研究院，安徽省中药研究与开发重点实验室，安徽合肥 230051)

痛经贴剂由枳壳、陈皮、赤芍、当归、延胡索、冰片等八味中药组成，具有行气止痛，活血化瘀的功效，用于治疗气滞血瘀型原发性痛经。本方中枳壳和陈皮同属芸香科植物，具有理气作用，故作为君药。柚皮苷、新橙皮苷为枳壳主要有效成分，橙皮苷为陈皮主要有效成分，且柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷均属黄酮类成分［1－3]。为有效控制痛经贴剂的质量，本实验采用高效液相色谱法同时对柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷进行测定并进行了方法学考察，方法简单、可靠、稳定性好。

1 仪器与试药

岛津LC-10AT型高效液相色谱仪(单元泵，SPD紫外检测器，岛津 LC solution Lite色谱工作站);TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);As3120B型超声波清洗器(北京恒奥德仪器仪表有限公司);METTLER TOLEDO XS105型电子天平(郑州龙腾达仪器设备有限公司)。柚皮苷对照品(批号:110722－200108);橙皮苷对照品(批号:110721－200512);新橙皮苷对照品(批号:111857－201102)均购自中国药品生物制品检定所;甲醇、乙腈为色谱纯;水为娃哈哈纯净水;其它试剂均为分析纯。痛经贴剂，自制，批号分别为:20141218、20141226、20150112。

2 方法与结果

2．1 色谱条件 色谱柱:Cosmosil-C18色谱柱(5 μm，4．6 mm × 250 mm);流动相:乙腈—0．1% 磷酸(21∶79);流速:1．0 mL · min－1;检测波长:分别取柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷对照品液适量，在200～400 nm波长范围内扫描，并参考药典，最终确定最大吸收波长为283 nm;柱温:25℃;进样量:10 μL。

2．2 对照品溶液的制备 精密称取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL中含柚皮苷80μg、橙皮苷60μg、新橙皮苷60μg的混合溶液，即得混合对照品溶液。

2．3 供试品溶液的制备 本品贴剂除去盖衬，取约1 g，精密称定，置锥形瓶中，加甲醇50 mL，称定重量，加热回流1．5 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2．4 空白溶液的制备 根据处方组成，取除枳壳和陈皮外的其余药材，按制备工艺要求制备不含枳壳和陈皮的空白样品，照“2．3”项下方法制备空白溶液，精密吸取10μL，按上述色谱条件进行测定，结果在柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷位置未见峰出现，表明空白溶液对样品测定无干扰。测定结果见图1。

2．5 对照品精密度试验 取“2．2”项下的混合对照品溶液，按上述色谱条件进行测定，连续进样6次，结果柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷峰面积RSD分别为 1．035%、1．716%和 0．899%，表明本法对照品精密度良好。

2．6 线性范围考察 精密称取柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL中含柚皮苷 0．34 mg、橙皮苷 0．25 mg、新橙皮苷 0．26 mg的混合对照品溶液，采用等比稀释法，即从10 mL上述对照品溶液中取5 mL，用甲醇定容至10 mL，再从10 mL中取5 mL用甲醇定容至10 mL，依次操作，分别得含柚皮苷 340、170、85、42．50、21．25、10．63 mg·L－1，橙皮苷 250、125、62．50、31．25、15．63、7．81 mg· L－1和新橙皮苷 260、130、65、32．50、16．25、8．13 mg·L－1的 6 份混合对照品溶液，按“2．1”项下色谱条件注入液相色谱仪进行测定，记录峰面积。以对照品进样量(μg)为横坐标X，以峰面积为纵坐标Y进行线性回归，得线性回归方程:柚皮苷 Y=18 015X －23 049，r=0．999 9(n=6);橙皮苷 Y=19 172X －20 620，r=0．999 9(n=6);新橙皮苷 Y=20 985X －23 203，r=0．999 9(n=6)。结果表明:柚皮苷在 10．63 ～340 mg·L－1浓度范围内线性关系良好，橙皮苷在7．81～250 mg·L－1浓度范围内线性关系良好，新橙皮苷在8．13～260 mg·L－1浓度范围内线性关系良好。

2．7 供试品精密度试验 取同一批号(批号:20141218)供试品，按“2．3”项下制备供试品溶液，再按“2．1”项下色谱条件注入液相色谱仪，连续进样6次，结果柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷峰面积RSD 分别为1．02%、1．29%和1．94%，表明本法供试品精密度良好。

2．8 重复性试验 取同一批(批号20141218)痛经贴剂样品，按“2．3”项下供试品溶液制备方法制备6份供试液，按“2．1”色谱条件注入液相色谱仪进行测定，并按外标法以峰面积计算含量，结果柚皮苷的含量为 6．09、6．05、5．97、5．81、5．89、5．97 mg·g－1，平均值为5．96 mg·g－1;橙皮苷的含量为5．23、5．14、5．1、5．14、5．01、5．06 mg·g－1，平均值为5．11 mg · g－1;新橙皮苷的含量为 3．76、3．72、3．66、3．85、3．8、3．82 mg·g－1，平均值为 3．77 mg·g－1。柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的溶液含量的RSD分别为1．71%、1．48% 和 1．86%，表明本法重现性良好。

2．9 稳定性试验 取同一批(批号20141218)的供试品溶液，分别于 0、1、2、4、6、8 h，按“2．1”项下色谱条件测定，记录其峰面积，结果柚皮苷的峰面积分别为 2 253 621、2 272 347、2 317 384、2 255 391、2 282 744、2 203 981，平均值为 2 264 245;橙皮苷的峰面积为2 143 612、2 160 111、2 155 815、2 086 990、2 202 010、2 127 881，平均值为 2 146 070;新橙皮苷的峰面积为 1 640 164、1 651 908、1 650 799、1 582 536、1 608 589、1 598 429，平均值为 1 622 071。柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷峰面积RSD分别为1．65%、1．78% 和 1．83%。结果表明，供试品溶液在8 h内稳定。

2．10 加样回收率试验 精密称取除去盖衬的同一批号已知含量的痛经贴剂(批号20141218，柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量分别为5．86 mg·g－1、5．04 mg · g－1和3．68 mg · g－1)6 份，每份约0．5 g，置锥形瓶中，再分别加入柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷浓度分别为 0．312 4、0．263 2 和 0．185 8 mg·mL－1的对照品混合溶液10 mL，精密加入甲醇40 mL，称定重量，加热回流1．5 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，按“2．1”项下色谱条件进行测定，计算回收率。结果见表1～3。

表1 柚皮苷加样回收率(n=6)

表2 橙皮苷加样回收率(n=6)

表3 新橙皮苷加样回收率(n=6)

2．11 样品测定 取本品样品 3批(批号:20141218，20141226，20150112)，按“2．3”项下制备供试品溶液，按“2．1”项下色谱条件测定，3批样品中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量结果见表4。

表4 柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷含量测定结果

3 讨论

3．1 波长的选择 药典2010版一部枳壳、陈皮采用高效液相色谱法测定柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷含量，测定波长均为283 nm，且采用紫外分光光度计在200～400 nm波长范围内扫描，结果显示柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷均在283 nm下有最大吸收，参考相关文献［4－5]，最终确定选择283 nm为最大测定波长。

3．2 流动相的选择 分别对甲醇—醋酸—水［6－8]和乙腈—0．1%磷酸［9－11]两种流动相的不同比例进行了考察，结果甲醇—醋酸—水系统为流动相时橙皮苷峰形较宽，且新橙皮苷峰与杂质峰分离效果较差，当甲醇—醋酸—水比例为(35∶1∶64)时，新橙皮苷峰分离效果较好，但出峰时间较长，而乙腈—0．1%磷酸系统为流动相时出峰时间短，峰形和分离度都较好，通过对其流动相不同比例进行比较，结果表明柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷在乙腈—0．1%磷酸(21∶79)流动相下的峰形、分离度和出峰时间都较为理想，且空白对照无干扰。

3．3 提取方法的选择 分别比较了用甲醇超声提取［12－13]30、60 和90 min 及用甲醇加热回流提取［14]30、60和90 min，根据柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量测定结果，最终确定用甲醇加热回流提取90 min，可将这三种成分提取的比较完全。

3．4 柱温的选择 分别比较考察了20、25、30℃柱温对柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷出峰时间及峰形的影响，结果表明25℃柱温下效果最好，故选择25℃作为柱温。

3．5 色谱柱的选择 本实验分别考察了3种色谱柱 Cosmosil－C18(5 μm，4．6 mm ×250 mm)、Phenomenex－C18(5 μm，4．6 mm ×250 mm)、Welchrom－C18(5μm，4．6 mm ×250 mm)对样品中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的分离效果，结果Welchrom－C18色谱柱分离度较差，Cosmosil－C18和Phenomenex－C18色谱柱的分离效果、峰形均良好，但Cosmosil－C18柱的出峰时间较早，故选择Cosmosil－C18柱作为本实验的色谱柱。

4 结论

本实验建立的HPLC法同时测定痛经贴剂中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量方法，具有操作方便、准确可靠及重复性和稳定性好的优点，可作为痛经贴剂的质量控制方法。

［1] 李伟伟，张国伟．陈皮黄酮类成分研究进展［J]．中国医学创新，2014，11(24):154 －156．

［2] 龚丽丽．枳壳类药材化学成分及药理研究［J]．亚太传统医药，2014，10(16):39 －40．

［3] 季 忆，陈建真，陈建明．枳壳黄酮类成分的研究进展［J]．中国中医药信息杂志，2010，17(11):105 －107．

［4] 国家药典委员会．中国药典(一部)［S]．北京:中国医药科技出版社，2010:229－230．

［5] 徐海燕，金 艺，张红霞，等．HPLC同时测定胃力片中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量［J]．中成药，2010，32(8):1355－1357．

［6] 杨佳静，薛 佳，周华方，等．HPLC法同时测定胃苏颗粒中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量［J]．中国药房，2014，25(4):372－374．

［7] 王祝枝，王晓华，朱 玉，等．正交实验法优选佛手的醇提工艺［J]．安徽医药，2014，18(1):26 －29．

［8] 马向东．HPLC测定枳术安胃胶囊中柚皮苷和新橙皮苷的含量［J]．海峡药学，2014，26(7):65 －66．

［9] 康四和，周 锐，聂 晶．HPLC测定小儿消积止咳口服液中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量［J]．中成药，2010，32(12):2088－2091．

［10]陈晓明，王 巍，闵庆璐．HPLC同时测定木香分气丸中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量［J]．中国实验方剂学杂志，2012，18(19):115 －117．

［11]蒋俊春，孟建升．HPLC法同时测定及砂和胃胶囊中橙皮苷、柚皮苷和新橙皮苷的含量［J]．中华中医药学刊，2014，32(6):1496－1498．

［12]刘玉春，张 静．HPLC同时测定橘红枇杷胶囊中橙皮苷、柚皮苷的含量［J]．安徽医药，2013，17(12):2044 －2045．

［13]丁 毅，弓晓东，谈瑄忠，等．HPLC同时测定通腑理气颗粒中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷含量［J]．中国中医药信息杂志，2012，19(5):53 －55．

［14]张金莲，何 敏，谢一辉，等．高效液相色谱法测定枳壳饮片中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量［J]．中国实验方剂学杂志，2010，16(6):68 －70．