肺结核患者NO和FOXP3表达水平变化及意义

沈丽燕，申卫红，朱 岚

（南京医科大学附属苏州医院生殖与遗传中心，江苏苏州 215001）

肺结核患者NO和FOXP3表达水平变化及意义

沈丽燕，申卫红，朱 岚

（南京医科大学附属苏州医院生殖与遗传中心，江苏苏州 215001）

目的探讨肺结核患者一氧化氮（NO）和叉头蛋白3（FOXP3）表达水平的变化及临床意义。方法选择肺结核患者与健康者各40例，采用Griess比色法检测血清NO水平，采用流式细胞仪检测外周血CD4＋CD25＋T淋巴细胞百分比；采用实时定量聚合酶链反应检测FOXP3 mRNA水平。结果肺结核患者血清NO浓度为（15.71±1.26）μmol/L，高于健康者的（5.45± 0.98）μmol/L（P＜0.05）；肺结核患者外周血CD4＋CD25＋T淋巴细胞约占CD4＋T淋巴细胞的（4.57±0.85）%，高于健康者的（1.83±0.49）%（P＜0.05）；肺结核患者外周血CD4＋CD25＋T淋巴细胞高表达FOXP3。结论肺结核患者NO、FOXP3表达水平均升高，在肺结核免疫调节机制中起着重要作用；动态监测二者表达水平的变化有利于肺结核患者的诊治。

一氧化氮； 叉头蛋白3； 肺结核

肺结核是由结核分枝杆菌引发的肺部感染性疾病，与T淋巴细胞介导的细胞免疫反应密切相关，其中调节性T淋巴细胞（Treg）在其中占重要作用［1］。Treg是一类具有免疫抑制功能的T淋巴细胞，在维持机体免疫自稳、调控免疫应答方面起重要作用，特征性表达转录因子叉头蛋白3（FOXP3）［2－3］。一氧化氮（NO）由具有多种生物学活性，由NO合成酶（NOS）催化合成。NOS可分为基础型（c NOS）及诱导型（iNOS）。研究发现，结核分枝杆菌感染巨噬细胞后，能诱导NO的产生，从而发挥炎症介质和细胞毒作用，杀伤结核分枝杆菌［4－5］。为了解NO和FOXP3在肺结核发病机制中的作用，本研究检测了肺结核患者NO、FOXP3水平，探讨二者与肺结核免疫功能紊乱的关系，以期为肺结核的免疫治疗提供新的方向。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2012年6月至2013年3月在无锡市第三人民医院呼吸科住院治疗的结核病患者40例（实验组），诊断标准符合《肺结核诊断和治疗指南》［6］；男26例、女14例，年龄20～75岁，平均（40.5±11.2）岁。与研究组性别、年龄相匹配的体检健康者40例纳入对照组。所有受试者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 NO检测 采集受试者晨起空腹静脉血4 m L，3 000 r/min离心10 min，分离血清标本，采用上海杰美基因医药科技有限公司Griess比色法NO检测试剂盒检测血清NO水平。

1.2.2 CD4＋CD25＋T淋巴细胞亚群检测 采集受试者枸橼酸钠抗凝静脉血2 mL，取全血标本100μL，加入PE标记的CD4抗体、FITC标记的CD25抗体（美国BD公司）各10μL，室温避光孵育30 min；加入红细胞裂解液（美国BD公司），振荡混匀；离心后弃上清液，磷酸盐缓冲液洗涤后混匀，采用FACS Calibur流式细胞仪（美国BD公司）计数细胞，以Cellquest软件分析数据，计算CD4＋CD25＋T淋巴细胞百分比。

1.2.3 FOXP3 m RNA表达的检测 按照实时定量聚合酶链反应（RT－PCR）试剂盒（德国QIAGEN公司）说明书的要求，提取全血RNA，采用RT－PCR检测FOXP3 mRNA水平，以磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）作为内参基因。FOXP3扩增上游引物:5′－GAA CGC CAT CCG CCA CAA CCT GA－3′，下游引物:5′－CCC TGC CCC CAC CAC CTC TGC－3′。聚合酶链反应（PCR）循环条件:95℃5 min，94℃30 s、69℃30 s、72℃1 min循环30次。反应结束后设定最佳阈值，根据仪器给出的标准曲线和斜率，计算FOXP3相对表达指数。

1.3 统计学处理 采用SPSS18.0软件进行数据处理和统计学分析。计量资料以表示，两组间均数比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 NO浓度检测 实验组、对照组血清NO浓度分别为（15.71±1.26）、（5.45±0.98）μmol/L，实验组血清NO浓度高于对照组（P＜0.05）。

2.2 CD4＋CD25＋T淋巴细胞亚群检测 实验组、对照组外周血CD4＋CD25＋T淋巴细胞在CD4＋T淋巴细胞中所占比例分别为（4.57±0.85）%、（1.83±0.49）%，实验组高于对照组（P＜0.05）。

2.3 FOXP3 mRNA表达水平检测 实验组、对照组FOXP3 m RNA相对表达指数分别为4.42±0.31、2.08±0.26，实验组FOXP3 mRNA表达水平高于对照组（P＜0.05）。

3 讨 论

肺结核是较为常见的一类传染病，T淋巴细胞介导的细胞免疫反应和迟发性变态反应对结核病发病、演变及转归产生决定性影响。近年来，调控免疫反应的CD4＋CD25＋Treg细胞成为免疫抑制治疗的研究焦点。Treg特征性表达转录因子FOXP3，后者对CD4＋CD25＋Treg细胞发育及功能具有调控作用［7］。本研究结果表明，肺结核患者CD4＋CD25＋T淋巴细胞的数量明显高于健康者，提示结核分枝杆菌进入机体后，可在宿主细胞内大量寄生和繁殖，从而诱导T淋巴细胞介导的细胞免疫反应。NO是在NO合成酶（NOS）作用下由L－精氨酸转化而来。NOS是生成NO的关键酶。一方面，在c NOS的作用下，参与血管张力生理性调节过程；另一方面，iNOS激活后可介导血管内皮细胞损伤，产生大量的NO，从而参与免疫病理反应。本研究结果显示，肺结核患者血清NO水平高于健康者，表明NO水平的变化与肺结核的发生、发展有关，参与肺结核的免疫炎性反应［8－9］。

综上所述，肺结核患者CD4＋CD25＋T淋巴细胞数量明显升高，而CD4＋CD25＋T淋巴细胞又高表达FOXP3，说明FOXP3的高表达可能在肺结核发病机制中起重要作用。同时，肺结核患者血清NO水平也明显升高，表明NO的高表达也参与肺结核的免疫炎性反应。因此，在肺结核的治疗中，对NO和FOXP3介导的免疫耐受进行干预十分必要。动态监测NO、FOXP3表达水平的变化，有利于肺结核患者的诊治。这为进一步研究NO和FOXP3在肺结核发生、发展机制中的作用奠定了基础。

［1］Ribeiro－Rodrigues R，Resende CO，Rojas R，et al.A role for CD4＋CD25＋T cells in regulation of response during human tuberculosis［J］.Clin Exp Immunol，2006，144（1）:25－34.

［2］van Mierlo GJD，Scherer HU，Hameetman M，et al.Cutting edge: TNFR－shedding by CD4＋CD25＋regulatory T cells inhibits the induction of inflammatory mediators［J］.J Immunol，2008，180 （5）:2747－2751.

［3］Zhang L，Zhao Y.The regulation of Foxp3 expression in regulatory CD4（＋）CD25（＋）T cells:multiple pathways on the road［J］.J Cell Physiol，2007，211（3）:590－597.

［4］Jonna I，Mekonnen M，Abate E，et al.Resistance to first－line anti－TB drugs is associated with reduced nitric oxide susceptibility in Mycobacterium tuberculosis［J］.PLoS One，2012，7（6）:891－896.

［5］Martin IV，Bartek IL，Visconti K，et al.The response of mycobacterium tuberculosis to reactive oxygen and nitrogen species［J］.Front Microbiol，2011，2（2）:105－109.

［6］中华医学会结核病学分会.肺结核诊断和治疗指南［J］.中华结核和呼吸杂志，2001，24（1）:70－73.

［7］Churina EG，Urazova OI，Novitskiy VV.The role of Foxp3－expressing regulatory T cells and T helpers in immunopathogenesis of multidrug resistant pulmonary tuberculosis［J］.Tubercul Res Treat，2012，26（1）:1－9.

［8］Cavalcanti YV，de Almeida TM，de Almeida AF，et al.Foxp3 expression and NO production in peripheral blood mononucleated cells of communicants with pulmonary tuberculosis［J］.Scand J Immunol，2013，15（3）:120－125.

［9］Niedbala W，Cai B，Liu H，et al.Nitric oxide induces CD4＋CD25＋Foxp3 regulatory T cells from CD4＋CD25 T cells via p53，IL－2，and OX40［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2007，104（39）:5478－5483.

Study of NO and FOXP3 in patients with pulmonary tuberculosis

Shen Liyan，Shen Weihong，Zhu Lan
（Nanjing Medical University Affiliated Suzhou Hospital/Suzhou Municipal Hospital，Suzhou，Jiangsu 215001，China）

ObjectiveTo Study the expressions and significance of nitric oxide（NO）and forkhead box protein 3（FOXP3）in patients with pulmonary tuberculosis.MethodsSerum NO levels were measured by Griess colorimetric reaction.Flow cytometry was used to determine the number of CD4＋CD25＋T cells in peripheral blood.The expression of FOXP3 m RNA was measured by real－time polymerase chain reaction.ResultsSerum NO level in patients was（15.71±1.26）μmol/L，higher than the（5.45± 0.98）μmol/L of healthy controls（P＜0.05）.CD4＋CD25＋T cells comprised（4.57±0.85）%of CD4＋T cells in patients，higher than the（1.83±0.49）%in healthy controls（P＜0.05）.CD4＋CD25＋T cells in the peripheral blood of patients with pulmonary tuberculosis highly expressed FOXP3.ConclusionPatients with pulmonary tuberculosis could be with an increased level of NO and FOXP3，which might have important role in the pathogenesis of pulmonary tuberculosis.

nitric oxide； forkhead box protein 3； pulmonary tuberculosis

10.3969/j.issn.1673－4130.2015.10.019

A

1673－4130（2015）10－1364－02

2015－02－08）

沈丽燕，女，检验师，主要从事临床免疫学检验研究。