Wistar大鼠SHG-44脑胶质瘤动物模型建立①

李英夫，李明军，廉晓宇，宣兆博，鲁艳梅，涂丽莉

(佳木斯大学附属第一医院神经外科，黑龙江 佳木斯 154003)

Wistar大鼠SHG-44脑胶质瘤动物模型建立①

李英夫，李明军，廉晓宇，宣兆博，鲁艳梅，涂丽莉

(佳木斯大学附属第一医院神经外科，黑龙江 佳木斯 154003)

目的：建立Wistar大鼠SHG-44脑胶质瘤模型，为胶质瘤药物的药效学研究提供实验基础。方法：采用立体定向技术，将体外培养的SHG-44胶质瘤细胞浓缩悬液，5×106/10μL接种于Wistar大鼠的右侧尾状核区，种植后连续观察大鼠的生存状态，并于7d行MRI扫描，将未成瘤的大鼠去除，分别于7d、14d、21d、自然死亡几个区间观察大鼠的生存状态，21d处死和自然死亡的大鼠，取脑制作病理切片，HE染色，光镜下观察。结果：1周内均较活泼，全部正常，术后1～2周表现为表现为精神萎靡，反应迟钝，食欲不振，活动减少，体重下降，步态不稳，2周后上述症状加重，逐渐有死亡的大鼠。HE染色可明显观察到大鼠脑胶质瘤的形成。结论：建立的Wistar大鼠SHG-44脑胶质瘤动物模型可靠稳定， 其肿瘤生长特性及病理特征与人脑胶质瘤相似，可作为临床胶质瘤研究的理想模型。

脑胶质瘤模型；Wistar大鼠；SHG-44； 病理学

神经胶质瘤发病率高，是颅内常见的恶性肿瘤，约占颅内肿瘤的35.26%～60.96%[1，2]，胶质瘤是恶性肿瘤之一，威胁着人类的健康， 目前胶质瘤的治疗以手术治疗为主，术后给予放疗和化疗，以及其它方面的治疗，包括基因治疗、免疫治疗等，但是胶质瘤的预后较差，随着胶质瘤研究的逐渐深入，需要建立稳定的胶质瘤模型，是临床药效学评估的基础，C6胶质瘤细胞来源于Wistar大鼠的额叶，SHG-44来源于人胶质瘤细胞，从生物学特性上看，更接近于人的胶质瘤细胞，将SHG-44细胞接种于Wistar大鼠右侧尾状核区，肿瘤细胞植入成功，血脑屏障也逐渐建立，因此Wistar大鼠SHG-44脑胶质瘤模型更接近于人类的脑胶质特性，这是更理想的胶质瘤模型，本课题组参照其它相关文献[3～6],成功建立Wistar大鼠SHG-44脑胶质瘤模型，现将具体情况报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验材料

SHG-44细胞株，Wistar雄性大鼠，体重160～200g。试剂主要包括：F12K培养基、胎牛血清、马血清， 10%甲醛平衡灌注固定液胎牛血清。主要仪器包括:超净工作台，脑立体定向仪，倒置显微镜，MCO175 型二氧化碳培养箱， 25μL微量注射器，台式冷冻离心机。

1.2 实验方法

1．2.1SHG-44细胞悬液制备

SHG-44来源于人额叶星形胶质瘤的稳定培养，具有特异性标志胶质酸性纤维蛋白(GFAP)，SHG-44是目前较理想的细胞株，能够稳定的培养，并在Wistar大鼠尾状核区成功植入，将复苏成功的SHG-44细胞株，放于50cm2培养瓶中接种，DMEM培养基中含有10%灭活的胎牛血清，还含有链霉素100mg/mL、青霉素100U/mL、NaHCO33.7g/L，培养瓶置于5%CO2的培养箱中，温度恒定于37℃，SHG-44细胞满瓶后,将培养液倾倒出去,0.25%胰酶消化培养瓶中的SHG-44细胞,显微镜下观察SHG-44细胞，当细胞开始皱缩时,加入营养液,并反复吹打，使SHG-44细胞脱壁,并用离心机离心5min，离心转数为1000r/min，将上清液弃出，制成106细胞/瓶的细胞悬液,接种于25cm2培养瓶中。

1.2．2 动物模型制作前准备

全实验过程每周两次注射地塞米松，0.15mg腹腔内注射，接种前3d，每日给予地塞米松，剂量为100g体重1mg，给药方式为灌胃，降低排斥反应，用10%水合氯醛麻醉，给药剂量为每100克体重0.4mL，剪去穿刺点周围毛，面积约1.0cm×1.5cm。

1.2.3 模型制作

植入靶点为右侧尾状核区，穿刺点为矢状缝右旁开3.5mm和前囟中点前1.0mm，麻醉满意后，将Wistar大鼠固定于立体定向仪上，剪去穿刺点周围毛,高效碘消毒,铺无菌洞巾，切开内眦连线与正中矢状面交点向后1mm，定位预先穿刺点，牙科钻颅骨钻孔，直径1.2mm，用1mm微量注射器针头刺破硬膜，向下垂直进入硬膜下6mm, 再后撤1mm，将细胞悬液1×106/20μL，以每分钟1μL的速度缓慢注入右侧尾状核区，穿刺针停留5min，骨蜡封闭骨孔，缝合头皮。

1.2.4 观察指标

7d时进行头部MRI检查，将成瘤的大鼠作为实验对象，分别于接种后的7d、14d、21d、自然死亡的几个时间点观察大鼠的生存状态，包括如下几个方面：饮食情况；肢体是否有活动障碍；颅神经是否有功能确实；以及视觉反应；全身抽搐和持续时间等。21d处死大鼠和死亡的大鼠进行H-E染色，光镜下观察[5]。

2 结果

2.1 脑瘤鼠行为学表现为

大鼠术后1d逐渐恢复饮食及活动，2d后基本恢复到术前状态，1周内均较活泼，全部正常，术后1～2周表现为表现为精神萎靡，反应迟钝，食欲不振，活动减少，体重下降，步态不稳，2周后上述症状加重，逐渐有死亡的大鼠。移植的Wistar大鼠动物50只，颅内出血致死4%(2/50),感染致死6%(3/50),意外伤害致死2%(1/50),颅内成瘤21只，成瘤率42%。

2.2 组织病理学

以多聚甲醛灌注主动脉，取肿瘤组织，甲醛固定，制成标本，用HE染色，显微镜下表现为核大、染色较深，并在肿瘤中心区切片可见坏死区，边界不清。

3 讨论

胶质瘤为中枢神经系统的恶性肿瘤，如何提高其治疗效果，延长患者生命，科研工作者和神经外科医生在不断的探索，VottorionM等认为[7]，理想的脑胶质瘤动物模型应具备以下特点：具备恶性胶质瘤细胞的生物特性；体外培养能生长；成瘤的时间较短，能够测定肿瘤的生长率，动物生存期稳定；肿瘤模型与人脑胶质瘤相似的生长特性；用于治疗的模型须能够模拟人脑胶质瘤临床治疗过程。本课题组用立体定向方法将SHG-44细胞植入到Wistar大鼠右侧尾状核区域，成功建立Wistar大鼠脑胶质瘤模型，大鼠成瘤后可出现明显的行为学改变，有较典型的症状。H-E染色，光镜下观察肿瘤呈侵袭性生长，建立的Wistar大鼠SHG-44胶质瘤动物模型基础上，观察大鼠的行为学改变，为抗胶质瘤药物的药效学研究提供了借鉴，更好的选择时间窗。

脑胶质瘤原位移植瘤动物模型的成功建立，应从以下几个方面严格操作，现做如下总结，模型制作过程，要求操作精细，控制好细胞数量、细胞增殖活力、靶点的确定、进针的速度和深度以及与靶点脑组织接触时间，细胞注射速度等方面严格操作，首先保证细胞的数量和活力，接种SHG-44大鼠脑胶质瘤细胞活力应>90%，达不到标准不能操作，接种前将细胞悬液置于恒温摇床中，温度恒定于37℃，留置时间不超过90min，接种前轻轻摇晃，以保证细胞悬液均匀，接种细胞的数量是影响模型成功率的关键，要保证细胞的数量，其次，穿刺针进入不能过深，也不能过浅，过深会导致大鼠死亡，过浅细胞 会向外溢出，把握好进针深度，是模型能否成功的关键因素之一，注射SHG-44悬液要把握好注射速度，保证细胞悬液植入在脑内，缓慢退针后，骨腊封闭骨孔，通常在肿瘤生长较慢的时期，进行对比实验能更好地判定治疗效果[8]。成瘤的大鼠，7d大鼠脑内肿瘤己经形成，但其生存状态良好;7～14d随诊肿瘤的生长，大鼠表现为食欲减退、反应下降，14d后上述症状明显，部分大鼠出现偏瘫、眼眶淤血、精神萎靡、体重下降较快。从以上观察看，进行药效学观察的时间点选在接种后10～14d为好。总之，按照上述方法进行的脑胶质瘤模型的制备，可以达到临床脑胶质瘤药效学研究的要求，因此，Wister大鼠SHG-44脑胶质瘤模型是可靠的动物模型。

[1]王忠诚主编. 王忠诚神经外科学[M]. 湖北：科学技术出版社, 2004,518

[2]WaraWM,BanmanGS,Sneedpk,etal.Brain,Brainstem,andCerebellum.InPerezCA,BrdyLM,eds.PrinciplesandPracticeofRadiationOncology[M].Philaddelphia:Lippincott-RavenPublishers, 1998,800-810

[3]GrobbenB，DeDeynPP，SlegersH，etal．RatC6gliomaasexperimentalmodelsystemforthestudyofglioblastomagrowthandinvasion[J]．CellTissueRes， 2002，310(3):257-270

[4]姬西团，章翔，陈燕，等． 立体定向大鼠脑胶质瘤颅内接种生长情况的观察[J]． 中国神经免疫学和神经病学杂志，2005，12 ( 5) :311-314

[5]吴景文，章翔，高大宽，等． 建立大鼠C6脑胶质瘤模型与观察颅内肿瘤生长[J]． 第四军医大学学报， 2000，21(3):307-310

[6]WatanabeK，SakamotoM，SomiyaM，etal．FeasibilityandlimitationsoftheratmodelbyC6gliomasimplantedatthesubcutaneousregion[J]．NeurolRes，2002，24:485-490

[7]蔡山，杨智勇.脑胶质瘤原位移植瘤动物模型的研究进展[J].实用临床医学，2007,8(2)：134-138

[8]白永文，于如同，倪鸣山，等．大鼠脑胶质瘤动物模型的建立及其形态学的初步观察[J]．徐州医学院学报，2004，24 (4):331-334

黑龙江省卫计委课题项目，编号：2014-222。

李英夫(1979～)男，黑龙江明水人，硕士，主治医师。

李明军(1965～)男，黑龙江佳木斯人，学士，主任医师。E-mail:liyingfu79@sohu.com。

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1008-0104(2015)02-0024-02

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