基因沉默的工具－RNA干扰技术的研究进展

赵雪萌 余祖江

(郑州大学第一附属医院 感染科 河南 郑州 450052)

RNA 干扰(RNA interference，RNAi)是指与靶基因序列同源的双链RNA(dsRNA)所诱导的转录后基因沉默现象，是真核生物抵御病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制，也可替代基因敲除、核酶、反义核酸等进行基因沉默相关研究。众所周知，基因的表达具有选择性，我们发现生物体内存在一套RNA 监视系统，能通过多种途径产生异常dsRNA，诱发RNAi，激活抑制基因，控制活跃基因，从而参与基因选择性表达。目前RNAi 技术因其操作简单、特异性强、高效性等特点，被广泛应用于植物的抗病毒研究、药物靶基因的筛选、肿瘤治疗等领域［1］。现对RNAi 的进展做一综述。

1 RNA 干扰的发现

RNAi 现象首次发现于植物中。1990年，Jorgensen 的实验室为使矮牵牛花的紫色花色加深而在植物中大量引入了同源编码紫色的基因，但却开出了白色或斑片状的花朵。这种引入同源基因而致基因表达受抑制的现象在当时被称为共抑制［2］。1995年Younis 等［3］发现在秀丽新小杆线虫中注射双链RNA 后导致的基因沉默现象比注射单链正义或反义RNA 更为有效。随后更多的研究表明，从线虫到几乎所有真核生物，包括原生动物，无脊椎动物，脊椎动物，真菌和藻类均存在这种现象［4－6］。这种引入双链RNA 导致特异性基因沉默的现象被称为“RNA 干扰”。后逐渐证实植物中的转录后基因沉默(posttranscriptional gene silencing，PTGS)、共抑制(cosuppression)及病毒诱发的基因沉默、真菌的抑制(quelling)现象均属于RNAi 在不同物种的表现形式。

2 RNA 干扰的机制

2.1 RNA 干扰过程 RNA 干扰过程包括起始阶段和效应阶段［7］。在起始阶段，dsRNA 在核酸酶(Dicer 酶)作用下切割成21 ～23 bp 双链小分子干扰RNA(small interference RNA，siRNA)，在效应阶段与siRNA Agohaute 2 蛋白酶等结合，形成RNA 诱 导 的 沉 默 复 合 物(RNA－induced silencing complex，RISC)，随后在ATP 提供能量及解旋酶的作用下双链siRNA 解旋成单链，形成含单链siRNA 的RISC，又被称为有活性的RISC。活化的RISC 与目标mRNA 分子结合，抑制基因表达。同时研究表明siRNA 除了通过上述方式与mRNA 结合介导转录后基因沉默外，还可以通过碱基配对原理，指导DNA 甲基化酶结合到DNA 特定部位，引发该部位DNA 中胞嘧啶的甲基化，介导转录水平基因沉默［8］。RNAi 作为体内的监视系统，通过上述两种方式，积极参与了基因选择性表达过程。

2.2 引发RNA 干扰的小分子来源 引发RNA 干扰的小分子RNA 有多种来源，主要分为内源性和外源性。内源性干扰小分子的代表micro RNA，为一种内源性非编码的21 ～25 bp 的单链RNA，是首先由细胞核内非编码RNA 在核酸酶的作用下形成前体miRNA(pri－miRNA)，后在Drosha 酶的作用下形成含有发夹结构的pri－miRNA，再在Dicer 酶作用下形成约22 nt的micro RNA。根据其与靶序列配对的程度，其作用方式包括两种，如配对程度高则可以与mRNA 结合后使目的基因降解，如配对程度低则可结合mRNA 的3’UTP 部位抑制mRNA 的翻译［9］。众所周知，在生物体代谢过程中会产生大量无功能RNA(aberrant nonfunctional RNAs)，通过micro RNA 的清除或抑制作用，在基因水平上发挥了免疫监视功能。

外源性干扰小分子即为siRNA，大致有3 种来源:①可以人工合成，包括体外人工合成一对序列互补的单链RNA(ssRNA)，导入体内后退火形成dsRNA，也可通过构建表达dsRNA的质粒，转入细胞表达dsRNA;②可通过RNA 依赖的RNA 聚合酶(RdRp)，识别异常的单链RNA(包括外来DNA 产生的RNA、病毒RNA 等)并以其为模板合成dsRNA 分子;③可以以干扰过程中RISC 剪切产生的siRNA 单链为引物，以mRNA 为模板合成dsRNA，这种过程被称为随机降解性多聚酶链反应(random degradative PCR)［10－11］，是产生siRNA 干扰放大效应的机制。siRNA 干扰本质上就是由RNA 介导的获得性免疫反应，是生物体抵抗外来基因的一种保护机制。

2.3 RNA 干扰的作用特点 RNAi 途径主要存在于细胞浆中，与反义核酸、核酶相比，RNAi 具有以下特点。①特异性。siRNA 是严格按照碱基配对法则与靶mRNA 结合的，故只引起同源mRNA 的降解。研究表明，在siRNA 21 ～23 个碱基中，错配1 ～2 个碱基就会大大降低干扰效应。②遗传性。dsRNA 分子可扩散至生物体各个细胞，干扰效应可遗传给后代。研究表明，通过注射或浸泡siRNA，在二代线虫中仍可观察到对靶基因的抑制作用［12］。但这种遗传效应可持续几代以及高等细胞中是否也存在上诉现象尚不明确。③位置效应。研究表明只有针对编码区的dsRNA 才产生干扰效应，对内含子区域的dsRNA 不产生干扰效应［13］。Kesharwani 等［14］根据人组织因子(human tissue factor，hTF)的不同位置合成了四组双链RNA 分别观察其干扰效应，结果显示hTF167I 和hTF372I 有85% ～90%的基因沉默效率，hTF562I 只能抑制部分基因，hTF478I 几乎无干扰效应。④放大效应。通过实验研究发现，少量dsRNA就能够使大量目的基因沉默，即使细胞增殖50 ～100 倍，这种沉默现象仍然存在，表明RNAi 存在扩增机制。

3 RNA 干扰的应用

3.1 基因研究新工具 通过RNAi 特异性抑制目的基因表达，从而了解该基因的功能，扩展基因文库，是RNA 干扰技术开展后最开始的应用方向。Yu 等［15］通过构建cyclin D1 的siRNA表达质粒，抑制cyclin D1 基因的表达，研究该基因对瘢痕疙瘩成纤维细胞的细胞增殖和细胞周期变化。同时RNA 干扰在信号传导通路的研究进展中功不可没。通过利用RNA 干扰技术进行基因组功能的分析可迅速建立基因与表型的关系，大大缩短实验时间，随着RNAi 技术的不断完善，它必将成为基因研究的强力工具。

3.2 疾病治疗的新方法 RNAi 技术还被广泛应用于肿瘤、病毒感染、遗传病等方面。Brummelkamp 等［16］将siRNA 导入人的胰腺癌细胞，特异性地抑制K－RASV12 的表达，使肿瘤的生长速度及恶性程度降低。对于基因突变引起的难治性遗传病如舞蹈病、肌萎缩性侧索硬化症，通过RNA 干扰技术，也可达到降低突变基因表达，改善病情的效果。Novina 等［17］通过针对HIV 受体CD14 和CCR5 设计siRNA，减少受体的表达，从而减少HIV 病毒感染。RNAi 作为新的抗病毒治疗武器，也应用于脊髓灰质炎病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒等研究中。RNAi 的大力发展，为疾病的治疗提供了新的策略。

3.3 药物开发及应用 近期研究表明，RNAi 还被应用于筛选药物及鉴定药物作用靶点。Duff 等［18］通过RNAi 技术减少蛋白转移酶9(PCSK9)的表达，发现能有效降低小鼠血清胆固醇水平，说明沉默PCSK9 可成为治疗高胆固醇的药物靶点。在药物筛选方面，有研究通过shRNA 发现维甲酸类药物能增强pk11 激酶抑制剂的抑制作用，加速癌细胞凋亡［19］。Zhou 等［20］的研究表明，Akt 是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，与胃癌化疗敏感性有关，通过RNA 干扰技术将Akt1 沉默慢病毒转入胃癌细胞株SGC－7901 和BGC－823，发现可显著提高对顺铂的敏感性。RNAi 的应用能明显缩短药物从开发到筛选出最有效药物的时间，在药学领域具有不可磨灭的功劳。

4 存在的问题

RNA 干扰应用广泛，但在临床应用时还存在几个重要障碍需要克服，包括先天免疫的激活、RNA 脱靶效应、剂量的调节及载体的选择等［21］。

合成的siRNA 在哺乳动物内能够激活天然免疫系统，通过刺激细胞质的模式识别受体，如双链RNA 依赖的蛋白激酶(PKR)，视黄酸诱导的基因Ⅰ(RIG－Ⅰ)和Toll 样受体(TLR)等，导致炎症细胞因子的激活(如TNF－α、IL－6)及干扰素反应(如IFN－α、IFN－β)，造成机体损伤。同时siRNA 也可引起一些非靶基因的非特异性沉默或表达上调，引起细胞的凋亡或生长抑制，这种现象被称为脱靶现象(off－target phenomenon)，目前考虑可能是外源性siRNA 诱发干扰素通路引起，或非靶基因具有的部分互补序列介导mRNA 降解［22－23］。在科研过程中siRNA 剂量的调节及载体的选择一样为我们带来了困扰，siRNA 具有高效性，较低浓度的siRNA 就能抑制靶基因表达，且研究表明siRNA 的干扰效应随其浓度的增加而增强，但过量的siRNA 不仅会导致与非靶mRNA 不完全互补配对的概率增加，同时可诱发更强烈的免疫反应，我们称为siRNA 的毒性。目前试验使用的最低有效浓度可达10 nM，不同细胞的有效浓度不同。siRNA 导入细胞的效率很低，现阶段最常见的载体有病毒载体、脂质体，其他载体介导如磷酸钙共沉淀等，目前应用最广泛的是脂质体，更多的转染方法等待我们进一步的研究。

5 展望

自RNA 干扰技术问世以来，这种分子干预方式已广泛应用于体外、体内基因的选择性表达，以及肿瘤、病毒感染等疾病的治疗，尤其是其在药物开发方面提供了新的思路，缩短了药效测试时间，并为多重耐药患者带来了福音。尽管在临床应用中，RNA 干扰存在免疫激活、脱靶现象等，我们相信这些问题最终会得到解决，RNA 干扰技术必将更为广泛地应用到基础研究、临床药物应用等方面，也必将成为人类基因组学研究的革命性工具。

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