肠道病毒71型感染致手足口病的抗病毒药物及疫苗研究进展

肠道病毒71型感染致手足口病的抗病毒药物及疫苗研究进展

王宏杰，邹映雪，张文双

手足口病;肠道病毒71型;抗病毒药物;疫苗

手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)是一种由多种肠道病毒引起的急性传染病，多发生于儿童，尤其是＜3岁的婴幼儿[1]，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要症状。少数患儿可并发无菌性脑膜炎、脑干脑炎、脑脊髓炎等严重神经系统疾病，预后差，病死率高[2]。此类患儿多数由肠道病毒71型(EV71)感染引起[3]。目前，针对EV71临床上尚无有效的抗病毒药物或已被批准的疫苗应用。因此，研制有效的抗EV71的药物及疫苗是未来医学研究的重点。现将近年来国内外有关EV71抗病毒药物、疫苗的研究进展综述如下。

1 病原学

EV71属于小RNA病毒科肠道病毒属成员，病毒的形态为无包膜正二十面体结构，大小约为33～35 nm[4]，基因组为一长约7．4 kb的单正链RNA分子，基因组两端为保守的3＇和5＇非编码区，中间为连续的开放读码框架，编码含2 194个氨基酸的多聚蛋白，可进一步水解为P1/P2/P3 3个前体蛋白，病毒的单链RNA具有感染性。根据基因序列的不同，进一步划分为A、B、C3个基因型，其中B型和C型又可进一步分为B1、B2、B3、B4、B5以及Cl、C2、C3、C4和C5亚型[5-6]。研究结果显示，一方面EV71毒性决定簇在基因族中并非单一位点，病毒的毒性是多个位点共同作用的结果;另一方面，复杂的宿主因素，对病毒的毒性也有影响[7]。

2 EV71 的抗病毒药物

目前临床上对EV71病毒感染主要是对症及支持治疗，因此研制有效的抗病毒药物成为目前的重要课题。

2. 1蛋白酶体系统抑制剂 有研究发现吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)发挥了潜在的抗EV71病毒的作用。经过PDTC处理的EV71感染Vero细胞，发现病毒RNA合成、病毒蛋白表达以及病毒子代的产生均受到明显抑制。相似于之前报道的PDTC对泛素蛋白酶体系统(UPS)的抑制作用，研究发现PDTC降低了EV71感染细胞的多泛素化蛋白水平。细胞周期调节蛋白p21和p53的增加积累进一步证实了PDTC 对UPS的抑制作用，它们通常通过UPS降解，然而本研究它们的水平没有变化。还发现PDTC对蛋白酶体的活性没有影响。因此，PDTC对UPS的下调作用是它对泛素化抑制作用的结果。更为重要的是，PDTC的抗病毒作用导致了对UPS的抑制作用; MG132作为一个强有力的蛋白酶体抑制剂，对EV71感染细胞的细胞病变效应和病毒蛋白合成产生明显的抑制作用。PDTC的抗氧化性能不能发挥其抗病毒作用，是因为N－乙酰－L－半胱氨酸作为一个强有力的抗氧化剂并不能抑制病毒的复制。病毒感染前2小时给予PDTC，然后在没有PDTC的培养基中进行培养，这种方法并不能抑制病毒的蛋白合成，但是PDTC的抗氧化作用没有改变。在病毒感染早期应用PDTC会显著地抑制由EV71感染引起的细胞凋亡。总之，PDTC作为一种潜在的抗病毒化合物具有抗病毒和抗凋亡双重作用[8]。EV71 3C蛋白酶在病毒的复制中完成多项任务，通过合成来自EV71病毒多聚蛋白裂解位点的一个小的荧光标记肽，检测EV71 3C蛋白酶的裂解效率。先导化合物的发现和优化的快速、高效的检测为针对3C蛋白酶的抗病毒药物的发展提供了理想的平台[9]。

2. 2 RNA聚合酶抑制剂 有研究发现6-溴-2-[1-(2，5-二甲基苯)-5-甲基-1H-吡唑-4-yl]喹啉-4-羧酸(BPR-3P0128)显示了很好的抗EV71病毒作用，BPR-3P0128在病毒感染的早期抑制病毒的复制，目标是EV71RNA依赖的RNA聚合酶以及VPg尿苷酰化，同时减少病毒RNA的累积水平以及抑制EV71的病毒复制[10]。有研究评估了27种核苷类似物，发现了一种腺苷核苷类似物(NITD008，此前报道其是专门抑制黄病毒的一种抗病毒试剂)，能够在Vero细胞中有效抑制不同EV71菌株的传播。磷酸化NITD008作为链终止的功能直接抑制EV71RNA依赖的RNA聚合酶的活动，但是不影响EV71VPg尿苷酰化过程。NITD008和rupintrivir (AG7088)(一种蛋白酶抑制剂)的协同抗EV71被记录在案，NITD008和其它抑制剂的潜在联合治疗来治疗EV71感染[11]。

2. 3 mRNA抑制剂 微小RNAs是一类小的非编码RNAs，长约20个核苷酸，在病毒生物学过程(包括抗病毒防御)的调节中发挥重要的角色。然而，微小RNAs在EV71复制及发病机制中的作用还未揭示。有研究发现miR-27a的表达显著地减少受EV71感染的细胞。有趣的是，在qPCR以及Western blotting中通过病毒滴定，miR-27a的过度表达能够抑制EV71的复制。通过计算分析和荧光素酶报告基因检测，研究者发现EGFR mRNA是miR-27a的一个真正的目标。此外，在qPCR以及Western blotting中，miR-27a能够降低EGFR的表达。而且，miR-27a对EGFR的抑制作用降低了Akt和ERK的磷酸化(方便EV71的复制)。结果显示R-27a通过抑制EGFR而发挥了抗EV71病毒感染作用[12]。

2. 4 B细胞免疫调节剂 研究发现EV71感染的小鼠体内的B细胞数量是减少的。去铁胺是一种海洋微生物天然产物，它可以补偿EV71感染鼠体内降低的B细胞水平。去铁胺治疗后中和抗体滴度也是升高的。此外，去铁胺减轻了EV71 感染引起的症状、死亡率以及肌肉的损伤。研究显示，去铁胺作为一种B细胞免疫调节剂，其有进一步抵抗EV71感染的潜能[13]。

2. 5芦竹碱衍生物 研究发现，基于细胞的测定中，芦竹碱和21芦竹碱衍生物有抗EV71病毒的作用。18衍生物显示了一定程度的抑制EV71作用，在此，它们有效的抑制病毒诱导的细胞病变效应，但是，芦竹碱铅化合物却没有抗EV71的作用。这种化合物作用在EV71感染的初始阶段，而不是直接的灭活病毒、抑制病毒的吸收或者影响病毒从细胞的释放。所有这些衍生物中，含有吡啶和苯并噻唑单元的复合物4S是最有抗EV71的潜力的。更进一步的研究表明，4s衍生物能够明显的抑制病毒RNA的复制，蛋白质合成以及病毒诱导的RD细胞凋亡。这些研究表明，4s衍生物或许是治疗EV71感染的一种可行的制剂，并且这些芦竹碱衍生物为进一步设计与合成潜在的抗病毒药物提供了有前景的途径[14]。

2. 6病毒异构体 以前的结构研究表明，EV71感染的细胞产生两种抗原性不同的结构形式，扩展的空衣壳(有时也被称为原壳体)和传染性病毒。EV71病毒的抗原表位揭示原壳体和病毒之间的结构是不同的。体外的结构功能研究表明，原壳体能够隔离抗体而增强EV71的感染。该研究的结果提示，EV71原壳体和病毒的构象不同为今后的抗病毒治疗提供了方法[15]。

3 EV71 疫苗

阻止EV71爆发的最有效手段是进行研发EV71疫苗。鉴于近年来手足口病在我国的爆发流行，故研制经济有效的疫苗显得尤为重要。

3. 1 EV71灭活疫苗 目前，亚洲有几个国家已经研发了EV71灭活疫苗。中国大陆有三家公司已经完成了灭活EV71全病毒疫苗的三期临床试验，而台湾和新加坡的两家公司也已经完成了一期临床试验。这些临床试验的结果表明，EV71疫苗具有高度安全性和免疫原性。EV71引起的手足口病保护率超过90%，EV71相关疾病的保护率超过80%[16]。以灵长类动物为模型的试验亦支持了上述观点。该研究评估了福尔马林灭活的EV71疫苗长期的免疫原性和安全性。在猕猴0、3、6周时用5～10 μg剂量的EV71疫苗接种，以AlPO4佐剂或者PBS作为对照。在长达56周的研究中，免疫接种的猕猴局部既无发热亦无红肿。一次免疫接种之后，EV71疫苗接种组血清中和抗体效价有4倍的升高，同时发现剂量依赖的IgG抗体反应。3次疫苗接种后EV71疫苗接种猕猴的中和抗体效价达到高峰，然后逐渐下降;然而，免疫接种猕猴的中和抗体滴度一直保持100%，直至试验结束[17]。

3. 2 EV71多聚蛋白疫苗 有研究通过毕赤酵母发现了一种经济有效的产生EV71多聚蛋白(P1蛋白)的方法，并且评价了P1蛋白作为抵抗EV71病毒一种候选疫苗的潜力。研究数据表明，P1蛋白产生了针对不同EV71亚型的持续高水平的交叉中和抗体，并且引起了明显的脾细胞增殖。高水平的IL-10和IFN-γ表明，P1蛋白诱导了Th1和Th2细胞的免疫反应。更有趣的是，接受P1蛋白免疫接种的雌鼠与其新生子代之间产生了抵抗不同EV71亚型的交叉保护反应。相对于热灭活的EV71来说，P1蛋白增强了体液和细胞免疫反应，并且显示了针对不同EV71亚型的良好的交叉保护作用。毕赤酵母产生的EV71P1蛋白是一种有前景的候选疫苗[18]。

3. 3构象疫苗 有研究对两种不同的空粒子的晶体结构进行分析:在没有明显的衣壳结构改变的情况下，外源性肽的插入能够很好的暴露于颗粒表面。重要的是，此种插入似乎不影响病毒的脱壳过程，而是说明，另一种重组病毒和EV71之间的脱壳过程的构象相似。此研究提供了抵抗手足口病的疫苗发展的见解[19]。

3. 4双价疫苗 福尔马林灭活的EV71疫苗能够阻止EV71的感染，而不能阻止COXA16的感染，下一步的目标是研究福尔马林灭活的EV71、COXA16双价疫苗，进而研制包括能够阻止其它柯萨奇病毒以及埃可病毒的多价手足口病疫苗[20]。有研究比较了四种单价疫苗和两种双价疫苗，包括福尔马林灭活的EV71病毒、EV71病毒样颗粒、福尔马林灭活的CVA16病毒、CVA16病毒样颗粒，以及福尔马林灭活的等效EV71 + CVA16病毒、EV71 + CVA16病毒样颗粒。IgG和中和抗体滴度表明，EV71和CVA16之间的免疫原性没有免疫干扰。在IgG的子类分型中，IgG1与IgG2b在所有的疫苗组分中占主要地位。此外，小鼠的血清中产生了抵抗EV71和CVA16亚型的交叉中和抗体。体内具有挑战性的试验研究表明，接受疫苗接种的动物免疫血清可以赋予新生鼠被动的免疫保护，而免于EV71的14 LD50以及CVA16的50 LD50的致命性挑战。研究结果表明双价疫苗在手足口病的疫苗发展中是很有前景的。病毒样颗粒具有比病毒灭活疫苗更为安全的优势，病毒样颗粒应该包括EV71和CVA16抗原，以此来阻断手足口病病毒的传播[21]。有研究基于乳化佐剂组合的效力递送系统设计与优化EV71候选疫苗，接着，对含有EV71/ CVA16联合抗原的鼠进行免疫原性研究。亚微米颗粒乳化的单一剂量的灭活EV71病毒颗粒诱发了潜在的抗原特异性的中和抗体反应，同时持续产生中和EV71的抗体反应。双价EV71/CVA16病毒颗粒的单一剂量的免疫原性研究表明，CVA16抗原不能引起CVA16中和抗体的产生反应，但是，不能影响EV71特异中和抗体反应。升压剂量的乳化双价EV71/CVA16候选疫苗对于获得高滴度CVA16特异中和抗体的产生反应的血清转换是必需的。本次研究的结果对于设计与发展手足口病及其它新兴传染病预防性疫苗是很重要的[22]。

直到现在尚无有效的商业化EV71疫苗上市，一旦EV71疫苗获得官方批准，就应该形成优化安全的以证据为基础的策略。EV71疫苗的免疫策略应该包括几个因素:目标人群的年龄，初次免疫剂量，加强剂量的需要，能否与其它疫苗同时使用，经济价值，计划能力，以及公众的认可程度。一旦EV71疫苗投放市场，必须通过大量的人群来监测疫苗的有效性和安全性，必须评估手足口病的流行病学，确保疫苗接种时机与流行病学相符。中国的评估尤其重要，因为全球没有其它的EV71疫苗[23]。

综上所述，手足口病近几年已经成为威胁公共健康的一种严重的肠道病毒传染病。由EV71引起者易引起严重的中 枢神经系统合并症，死亡率高。随着对于手足口病认识的提高，积极的救治明显减少了死亡率。积极加大抗EV71治疗的投入以研制有效的抗病毒药物，显得较为迫切，同时积极研究EV71病毒感染的发病机制，为提供临床切实可行的疫苗亦是今后的研究重点。

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R512. 57

A

1008-7044(2015)04-0412-03

10．14126/j．cnki．1008－7044．2015．04．058

天津市儿童医院感染科，300074

王宏杰(1977－)，男，天津市人，主治医师，研究生。

2015-03-10)