正交设计优选橘红痰咳颗粒提取工艺的研究

钱 方，薛非凡，莫慧琴

（1．襄阳市食品药品监督管理局 食品药品检验所， 湖北 襄阳 441021；2.襄阳市中心医院， 湖北 襄阳 441021）

橘红痰咳颗粒收载于卫生部药品标准中药成方制剂第14册，功能主治为理气祛痰、润肺止咳，用于感冒、支气管炎、咽喉炎引起的痰多咳嗽、气喘。处方由化橘红、百部（蜜制）、苦杏仁、茯苓、水半夏（制）、五味子、白前、甘草组成。由于制法中只规定了提取溶媒为水和提取次数，没有规定浸泡时间、加水量和提取时间，为此以化橘红中柚皮苷为考查指标，用正交设计对水提工艺进行了优选试验，采用正交设计L9（34），进行方差分析，以确定各因素中的显著性水平，从而优选出橘红痰咳颗粒最佳提取工艺参数。

一、仪器与试剂

LC-10A高效液相色谱仪，SPD-10AVP紫外检测器，CBM-102工作站，均由日本岛津仪器（苏州）有限公司提供；超声波清洗器（功率100 W，频率40 kHz），由昆山市超声仪器有限公司提供；柚皮苷对照品（批号110753-200413），由中国药品生物制品鉴定所提供；甲醇为色谱纯，其它试剂为分析纯。

二、方法与结果

（一）挥发油的提取工艺

分别称取处方量的化橘红和苦杏仁至蒸馏器中，水蒸汽蒸馏，提取挥发油；另器收集备用。

（二）药材提取工艺

按处方比例,称取处方量药材化橘红、苦杏仁加8倍量水浸泡24 h，水蒸汽蒸馏至提尽挥发性成分，药液过滤，滤液另器收集；药渣与其余6味药材加水煎煮2次，滤过；合并滤液，浓缩至稠膏状（相对密度为1.18～1.20，80℃），加乙醇使含醇量达75%～85%；静置（过夜），取上清液回收乙醇，浓缩到适量，定容至250 ml。

（三）提取工艺筛选

以L9（34）正交表安排试验，工艺优选因素及水平见表1。提取结束后，合并滤液减压浓缩至一定体积（250 ml），并测定柚皮苷的含量。

表1 提取工艺优选因素与水平

（四）HPLC法测定柚皮苷含量的方法学验证

1.色谱条件： 使用DiscoveryC18（5um，150mm×4.6 mm）为色谱柱；以甲醇-醋酸-水（35∶4∶61）为流动相；流速1 ml/min；柱温为室温（25℃）；检测波长为 283 nm；进样量 10 μl。[1-8]

2.供试品溶液制备：精密量取提取液2 ml，置50 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀即得。

3.对照品溶液的制备：精密称取柚皮苷对照品20 mg，置100 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀；精密量取3 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀即得（每 1 ml中含柚皮苷 60 μg）。

4.阴性对照溶液的制备：取无化橘红的所有药材按制法操作，制得无化橘红的阴性对照品溶液。

5.检测波长选择：取柚皮苷对照品溶液在200～400 nm作波长扫描，样品在283 nm有最大吸收。根据实验结果，检测波长为283 nm。

6.准确度（加样回收试验）：精密称取已知含量的橘红痰咳颗粒 (含柚皮苷9.68 mg/g)9份，其中0.08 g、0.1 g和0.12 g各3份，每份分别精密加入（0.136 mg/ml）柚皮苷对照液10.00 ml，照含量测定项下操作，测定柚皮苷的含量，计算回收率。平均回收率为98.5%，RSD=0.77%（n=9），符合含量测定要求。

7.精密度试验：取样品含量测定样品溶液6份，各进样10 μl，注入液相色谱仪。测定峰面积RSD为1.46%，表明本试验精密度良好。

8.专属性（阴性对照试验）：取供试品溶液、对照品溶液和阴性对照溶液照含量测定项下操作，阴性对照溶液在与主峰保留时间处无吸收峰。在上述条件下，对照品保留时间与峰形均理想，样品中主峰能与其他峰很好分离（见图1），说明阴性无干扰。

图1 橘红痰咳颗粒HPLC色谱图

9.溶液的稳定性：取含量测定项下的样品溶液，间隔1 h测一次，观察其溶液的稳定性，结果样品溶液至少在6 h内是稳定的（RSD=1.098%）。

10.线性与范围：精密称取柚皮苷对照品适量，加甲醇溶解并配制成浓度分别为 13.6 μg/ml、27.20 μg/ml、40.80 μg/ml、68.00 μg/ml、108.80 μg/ml、136.00 μg/ml的一系列溶液,取样10 μl，注入液相色谱仪,结果峰面积（A）分别为 152 552、316 293、464 811、805 261、1 324 796、1 629 188，回归方程为：Y=12186.5A-18908.89；r=0.999 8（n=6）。提示柚皮苷在 13.60μg/ml～136.00 μg/ml浓度范围内线性关系良好。

11.耐用性试验：改变流动相中有机相的量（±5%）、流动相的 PH（±0.2PH）、柱温（25℃，40℃）、流速（±0.2 ml），观察对结果的影响。结果提示，改变流动相中有机相的量、PH值、柱温、流速，对结果几乎无影响，说明耐用性较好。

三、数据处理及方差分析

实验数据见表2。

表2 正交试验L9（34）计算表

因本试验中无空白项,故直接以最小值为误差估计值来检验各因素的显著性,方差分析见表3。[9]

表3 方差分析表

根据柚皮苷含量测定的数据,分别计算各因素的离差平方和及第2类离差。因为本试验正交表中无空白列，故直接以第2类离差作为误差估计值（即：SE=SE2=5.13）来检验各因素的显著性。

由方差分析可知,因素C为有极显著意义的因素,因素A为显著意义的因素,因素B和D为无显著意义的因素,故橘红糖颗粒的最佳提取工艺为A1B3C2D1，即加水量为10倍，提取次数为2次,煎煮时间为1 h,浸泡时间为60 min。

四、工艺验证

提取工艺筛选取完成后，按上述条件与方法，对最佳提取工艺参数进行验证，测定柚皮苷含量（每袋）分别为 96.9 mg、95.9 mg、96.2 mg，实验结果表明,采用该工艺指标成分柚皮苷含量高，从而证明该提取工艺设计合理。

五、讨论

（一）流动相的选择

橘红痰咳颗粒质量标准中柚皮苷的含量测定流动相为：甲醇-水-冰醋酸（40∶59∶1），柚皮苷分离不好（拖尾）；[10]有人用乙腈-磷酸盐缓冲液（PH3.1）（20∶85)做流动相来测定橘红痰咳颗粒中柚皮苷的含量，[2]柚皮苷分离也不好;文献用甲醇-醋酸-水（35∶4∶61）对照品的保留时间较理想，[1]但峰形较差。用甲醇-0.025 mol/L磷酸溶液（取1.7 ml 85%的磷酸，用水稀释至1 000 ml，三乙胺1.8 ml调节pH至3.0±0.1）（40∶60）为流动相克服了拖尾现象，空白溶液在此无干扰，样品溶液中主峰能与其他色谱峰能很好地分离。故选此甲醇-0.025 mol/L磷酸溶液为流动相。

（二）含量测定的提取方法考察

加热回流提取的样品溶液较超声提取的溶液颜色深，两种提取方法的峰面积相当，考虑到杂质及操作方便等因素，选用超声提取方法为含量测定提取方法。

（三）超声时间考察

方法按超声提取法，只改变超声时间，20 min、30 min、40 min，考察含量测定结果分别为18.1 mg/g、19.9 mg/g、19.6 mg/g。结果显示：超声20 min含量低，超声30 min与40 min的含量相当，故超声时间定为30 min。

（四）正交实验结果

从9次实验结果可知,第3号试验所测柚皮苷含量最高,最佳的工艺条件为A1B3C3D3，即加水量为10倍，煎煮时间为1 h，提取次数为3次，浸泡时间为40 min。

从R行(极差)可知,因素对结果的影响幅度,数值越大对结果影响越大,数值越小对结果影响越小,因素的影响顺序为C＞A＞B＞D，说明因素C对结果的影响最大，因素A次之，因素B和因素D对结果影响较少。

从 K 值可知,因素 C中 K1=10.73，K2=17.18，K3=18.44，K1数值较小,K2和K3数值较接近,为方便生产，节约成本,选择提取两次即可。因素A中K1=47.98，K2=15.34，K3=13.03，即 K1＞K2＞K3。由于化橘红先进行了蒸馏操作，提取挥发油后的水溶液与药渣再进行水煎煮，此时的加水量对结果的影响相对少。为方便生产，节约成本，选择第一次加水10倍量,第二次加水8倍量。因素B和D中，K值较小对结果影响较小，且先进行了蒸馏操作，对结果的影响微不足道，故选择煎煮时间为B3（1 h），浸泡时间D1（60 min）。

综上所述，橘红痰咳颗粒最佳工艺为A1B3C2D1，即加水量为10倍，提取次数为2次，煎煮时间为1 h，浸泡时间为60 min。

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