沉默miR156表达的mimicry156载体的构建及转化烟草的研究

冯圣军　章玉婷　缪家顺　詹妮　朱祝军　于超　王华森

摘要：miR156在植物营养生长阶段幼年期向成年期的转变过程中发挥重要的调控作用，其通过降解SPLs基因mRNA和翻译抑制调控靶基因的表达。通过定向改造拟南芥内源性Target mimicry IPS1（INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION 1）构建了抑制miR156表达的mimicry156载体，并转化获得转基因烟草植株，转基因植株mimicry156对内源性miR156具有抑制作用。该方法为研究miR156在植物营养生长阶段的调控作用提供了方便有效的途径。

关键词：miR156；Target mimicry IPS1；表达载体；转化

中图分类号：Q785 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）01-0210-05

miRNA是真核生物中非编码的小RNA，在基因转录后的调控过程中发挥重要作用，一般位于编码蛋白质的基因之间，在高等植物编码蛋白质基因的转录产物中存在茎环（Stem-Loop）结构，经过一系列复杂的加工后，Dicer-Like（DCL）家族基因将茎环结构中大约21个核苷酸大小的成熟miRNA单链切割出来，其可以选择性地装载到RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）上，miRNA与靶标RNA进行互补配对，造成靶标RNA的降解或翻译抑制[1]，因而能在转录后水平专一性调控靶基因的表达。通常miRNA与其靶基因之间的表达呈负相关，即在组织水平上某个miRNA含量的增加往往伴随着其靶基因转录水平的下降，与转录抑制因子相比，miRNA能在转录后水平更迅速地调节靶蛋白质含量，显著缩短调控反应的延滞期，精确维持靶蛋白质的稳定状态，从而有效地调控植物的生长发育[2]、生物及非生物的胁迫响应[3]。

miR156在植物营养生长阶段幼年期向成年期转变过程中发挥重要的调控作用，其在拟南芥（Arabidopsis thaliana）[4]，玉米（Zea mays）[5]，苔藓（Physcomitrella patens）[6]、番茄（Lycopersicon esculentum）[7]，夏堇（Torenia fournieri）[8]、软枝草（Panicum virgatum L.）[9]、水稻（Oryza sativa）[10]等植物中都被证明是营养期转化的关键调控因子。miR156通过降解SPLs基因mRNA并通过翻译抑制调控靶基因表达，miR156的表达丰度随着植物发育进程逐渐降低的同时，解除了对SPLs基因的抑制从而顺利调控植物幼年向成年的过渡。

miR156等microRNA在植物中的重要调节作用已成为近年来研究的热点。正向遗传学研究法通过诱变剂处理，大量筛选突变体研究其表型和生理代谢。但是这种方法随机性较大，不易获得目的miRNA功能缺失的突变体，给研究带来了较大的障碍。靶基因模拟（Target mimicry，TM）技术的出现提供了一种新颖的miRNA研究方法。

植物中磷的生理平衡受复杂的调控系统支配，从而有效地控制植物的生长[11]。研究发现miR399、PHO2和IPS1形成反馈循环系统调节植物中磷的动态平衡。在缺磷胁迫下miR399诱导降解与其具有一段互补区域的PHO2 mRNA，PHO2能够编码一种E2泛素结合酶，而这种酶影响植物中磷的含量和再利用过程[12]。除了PHO2 mRNA能够与miR399互补结合外，研究发现TPSI基因家族的mRNA同样含有miR399的结合域，IPS1（INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION 1）属于TPSI家族的一员，但与miR399互补配对的IPS1不仅没有降解反而具有抑制miR399活动的效果[12]。与miR399调节PHO2的靶位点相比，IPS1在结合域的中心位点有3个核苷酸的插入，相当于miRNA调节靶基因结合区域的突起部分，从而阻止了miR399-RISC复合体对IPS1的切割，同时IPS1占据miR399，从而抑制其对靶基因的降解作用[13]。研究发现，IPS1作用原理同样可用于抑制其他miRNA的活动[13]，本研究通过定向改造拟南芥内源性IPS1构建抑制miR156表达的mimicry156载体，旨在为进一步研究miR156在植物营养阶段的调控作用打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料 拟南芥（Arabidopsis thaliana）哥伦比亚生态型（Col-0），烟草（Nicotiana tabacum）（NC89）均为浙江农林大学蔬菜品质改良重点实验室保存。

1.1.2 细菌菌株与质粒载体 根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌种GV3101，由pCambia3300改造的具有pUbi10 启动子的pSY06表达载体，均为本实验室保存。大肠杆菌（E.coli）菌种Trans5α Chemically Competent Cell，克隆载体 pEASY？誖-Blunt Cloning Kit均购自全式金生物技术有限公司（北京）。

1.1.3 酶及生化试剂 卡那霉素（Kan）、庆大霉素（Gen）、羧苄青霉素（Carb）和草甘膦（PPT）均购自Sigma 公司。高保真DNA 聚合酶PhusionTM High-Fidelity DNA Polymerase购自于美国NEB（NEW ENGLAND BIOLADS）公司。限制性内切酶SpeⅠ/BamHⅠ、T4 DNA 连接酶及反转录试剂盒、定量PCR试剂盒均为Takara公司（大连）产品。质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒购自生工生物工程股份有限公司（上海）。总RNA 提取试剂盒Trizol购自Invitrogen公司，引物合成、测序由华大基因有限公司完成。endprint

1.2 方法

1.2.1 拟南芥IPS1基因克隆 以缺磷培养的拟南芥（Col-0）为材料，依据Trizol试剂盒说明书进行总RNA 的提取，并进行反转录得到cDNA。根据IPS1的全长cDNA 序列，利用Primer Premier 5.0 引物设计软件在编码区两端分别设计扩增引物P1（5′-GGACTAGTATGGGGAGACAACCATGCTG-3′）和P2（5′-CGCGGATCCTCAAAACAACCCAAAAGTGG-3′）。P1引物的5′端加入 BamHⅠ酶切位点，P2引物5′端加入 SpeⅠ酶切位点，以拟南芥cDNA为模板，PCR 扩增IPS1基因。PCR 反应条件为94 ℃ 3 min， 94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 个循环；72 ℃延伸7 min。将获得的PCR产物经10 g/L的琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带，用胶回收试剂盒回收备用。

1.2.2 定向改造IPS1基因 定向改造IPS1基因，通过重叠PCR获得mimicry156目的片段。将IPS1上与miR399 结合的区域，通过设计特定引物P3（5′-CTTTGACAGAAGATAGAAGTGAGCATTTTCTA

GAGGGAGATAA-3′）和P4（5′-AAATGCTCACTTCT

A TCTTCTGTCAAGCTTCGGTTCCCCTCG-3′），改造为miR156与其靶基因结合区域，通过融合PCR的方法，以上述克隆到的IPS1基因为模板，分别以P1、P3和P4、P2作为引物分段扩增，得到2个克隆片段。然后用这2个片段为模板，以P1和P2为引物，通过融合PCR扩增，产物即为改造好的mimicry 156片段。扩增PCR 反应条件为94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 35 个循环；72 ℃ 7 min。融合PCR 反应条件为94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 个循环；72 ℃ 7 min。将获得的PCR产物经10 g/L的琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带，用胶回收试剂盒回收。

1.2.3 mimicry156载体的构建 将上述回收得到的目的片段进行定向连接，连接到克隆载体pEASY？誖-Blunt Cloning Kit上，连接产物转化到感受态大肠杆菌Trans5α，菌液经PCR和测序验证。提取阳性克隆质粒经SpeⅠ和BamHⅠ双酶切后，回收目的片段连入pSY06表达载体中，通过菌液PCR与SpeⅠ和BamHⅠ双酶切验证后，采用冻融法转入农杆菌GV3101中，-80 ℃保存菌株。

1.2.4 烟草的遗传转化与鉴定 利用农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草NC89[14]，通过50 mg/L PPT筛选转基因抗性植株，并提取T0代烟草转基因株系进行基因组PCR 鉴定。

2 结果与分析

2.1 定向改造IPS1为mimicry156

Target mimicry通过隔绝miRNA来调控miRNA对靶基因的降解活动，这种作用机制为miRNA的功能研究提供了异于传统遗传学且方便有效的途径。IPS1作为典型的内源性Target mimicry，在缺磷胁迫下与miR399共同维持植物体内磷代谢平衡。根据这种机制本试验将IPS1定向改造为抑制miR156表达的沉默载体。以缺磷培养的拟南芥cDNA为模板，通过PCR扩增出IPS1基因全长。通过设计特异性引物P3、P4，将IPS1与miR399的结合区域改造为miR156与其靶基因互补的区域（图1），利用重叠延伸的方法，以IPS1的编码序列为模板进行分段扩增（引物分别为P1、P3和P2、P4）。将2种PCR产物回收并作为模板，以P1和P2为引物进行融合PCR扩增，产物即为mimicry156，图2为重叠PCR的具体流程示意图。

2.2 植物表达载体的构建

mimicry156片段与pEASY？誖-Blunt Cloning Kit载体连接并转化到大肠杆菌Trans5α后，如图3A菌液PCR电泳结果所示，已筛选到了阳性转化子。测序结果进一步表明，阳性克隆的序列与设计的序列保持一致。用限制性内切酶SpeⅠ和BamHⅠ将质粒和pSY06进行双酶切，经回收后将目的基因片段插入表达载体pSY06、pUBQ10启动子的下游，构成mimicry156载体，将构建好的载体分别用SpeⅠ和BamHⅠ双酶切（图3B）并进行测序验证，结果证明mimicry156载体已构建成功。图3C结果表明，含mimicry156片段的pSY06植物表达载体已成功转化到农杆菌中。

2.3 烟草转mimicry156植株的鉴定

将构建好的表达载体转化农杆菌，通过农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草，获得转基因植株，图4为烟草的遗传转化过程。

为了检测转基因是否成功，以野生型和表现出除草剂（Basta）抗性的转基因烟草植株的基因组DNA为模板，通过bar基因和mimicry156序列设计的特异性引物barF（5′-GCGGTCTGCACCATCGTCAA-3′）、barR（5′-AAACCCACGTCATGCCAGTTCC-3′）和mimiF（5′-TCATGTAAGGAAAGCGTTTTAA-3′）、mimiR（5′-ACTGGTCTGACTATTCTCCAAA-3′）分别进行PCR扩增，鉴定转基因植株。从图5中可以看出，转基因植株基因组中扩增出bar基因和mimicry156片段，而野生型植株中没有扩增出相应片段，初步判定目的基因已整合到烟草的染色体上。

2.4 转基因烟草表型分析

将上述PCR检测获得的8株T0代阳性植株中的9号和34号株系T1代种子和野生型烟草种子播种于无菌土中，经4 ℃破休眠48 h后移入温室中，此时开始计算植株年龄，待小苗长出子叶后喷施Basta，筛选自交分离含T-DNA的植株，真叶长出后转基因植株与野生型植株表型逐渐表现出不同（图6A）。mimicry156植株表现出快速成熟的表型（图6B）：开花明显提前（图6C），叶片数量低于野生型植株（图6D）。相同时间内mimicry156超表达植株叶片发生速率明显低于野生型烟草（图6E）。endprint

3 讨论

miR156及其靶基因SPLs控制的营养生长阶段转变，被证明与植物一些重要的经济性状调控相关，如参与控制植物叶形、叶片大小、叶片发生速率、叶片扩展率、茎直径、不定根的发生、侧分支的形成、开花时间、花絮结构等。拟南芥超表达miR156可使幼年莲座叶数目显著增多，从而有效增加生物量，为生物能源开发提供了参考；对园艺作物番茄与观赏花卉夏堇的研究发现，miR156对作物株型的修整和果实形状大小的改变发挥重要的作用[7，8]；能源植物软枝草过表达miR156显著提高了叶片数量，为燃料的生产提供资源，同时针对性地表达miR156可提高可溶性糖的含量[9]。研究发现，miR156在植物多种营养物质合成路径中发挥重要的作用，Gou等[15]研究证实miR156活动的增加提高了拟南芥花青素的含量，揭示了花青素、黄酮等次生代谢产物受到miR156-SPLs的调节。新近研究发现，光合作用的主要产物—糖，能够作为一个可移动的信号分子抑制新生叶原基中miR156的表达，从而促进营养生长阶段转变的发生[16-18]。因此，研究miR156-SPLs在植物中的调控机制具有重要意义。

传统的遗传方法研究miRNA具有很大的局限性，Target mimicry的出现提供了一种全新的调节特定内源性miRNA表达量的方法。本试验通过RT-PCR方法克隆了拟南芥IPS1基因，同时定向改造为具有miR156结合位点的抑制miR156表达的mimicry156。为了进一步研究其对miR156的调节功能，构建了启动子mimicry156植物表达载体，并将其转化到烟草中。转基因植株基因组PCR和Basta检测表明，mimicry156已经整合到烟草染色体中，转基因后代与野生型对照相比，其叶片发生率降低，开花提前，表现出早熟的性状。上述结果表明，Target mimicry为miR156在植物间保守的调控功能提供了新颖的研究方法，为未来的研究奠定了基础。

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