术前尿液BLCA－4及IL－8水平与膀胱癌临床病理特征的关系及意义*

杨大富， 陆荣森， 廖 俊， 梁华良， 黄芳伟

(1.广东省信宜市人民医院泌尿外科， 广东 信宜 525300 2.中山大学附属第一医院泌尿外科， 广东 广州 510080)

膀胱癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率占泌尿系统瘤的首位［1］。根据2005年美国癌症中心统计，膀胱癌位列男性常见癌症第4位，女性常见癌症第10位［2］。基于不同程度风险的膀胱癌患者经尿道膀胱肿瘤电切术后，一年内仍有20% ～90%的高复发率［3］，因此对膀胱癌早期诊断和监测是治疗膀胱癌的核心。目前膀胱镜检查仍是膀胱癌确诊的金标准，但其具有侵入创伤性、不能准确确定肿瘤的分级和分期，不易早期发现病变等缺点。随着分子生物学的不断发展，越来越多的肿瘤标记物应用于诊断及监测膀胱肿瘤，其中膀胱癌特异性核基质蛋白－4(BLCA－4)和白细胞介素－8(IL－8)是其中的研究热点。本研究基于酶联免疫反应原理分别检测膀胱癌组患者、正常对照组和高危性膀胱癌人群中术前尿液中BLCA－4和IL－8水平，以探讨分析术前尿液中BLCA－4和IL－8水平与膀胱癌临床病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料:选择2011年5月至2013年5月我院收治的膀胱癌患者42例(膀胱癌组)，均经手术病理证实为移形细胞癌。其中男26例，女16例，年龄24～80岁，平均(45.6±14.1)岁。病程 9 ～50 个月，平均(25.3±7.6)月。大多数患者表现伴有无痛性，间歇性，全程肉眼血尿，尿频、尿急、尿疼等膀胱刺激症状，部分出现尿潴留现象。根据UIC标准病理分期:浅表性膀胱癌(T0～T1)24例，浸润性膀胱癌(T2～T4)18例;按照按WHO的病理分级标准［4］:G1期12例，G2期21例，G3期9例;初发性23例，复发性19例;单发性25例，多发性17例。所有患者术前均未接受放疗、化疗或免疫治疗，无肝炎、糖尿病及免疫系统等疾病。选择同期在本院进行体检的健康者28例(正常对照组)，男15例，女13例，年龄22～78岁，平均(46.2±12.8)岁;同时选取脊髓损伤的膀胱癌高危患者32例(高危性膀胱癌组)，男19例，女13例，年龄21～79岁，平均(45.9±15.7)岁。

1.2 术前尿液中BLCA－4和IL－8水平的测定

1.2.1 BLCA－4检测:取收集的正常对照组、高危性膀胱癌组和膀胱癌组患者术前24h的尿标本各100mL，用乙醇以1∶3比例固定30min后，收集沉淀尿蛋白，加入PBS缓冲液，置－80℃储存备用。BLCA－4检测试剂盒购于联科生物技术有限公司。测定时，首先将含尿蛋白的标本加到酶标板中，置4℃冻箱包被过夜。次日，PBS(磷酸盐缓冲液，PH=7.0)洗涤酶标板后加入Anti BLCA－4抗体，室温下孵育2h。再用含小牛血清的封闭液洗涤后加入酶标二抗，室温下孵育2h，PBS洗涤后加入底物显色，于405nm波长处读取 A 值。Cut－off值为:14.0A/μg.protein。

1.2.2 IL－8 检测:采用人白细胞介素－8(IL－8)ELISA检测试剂盒(上海百蕊生物科技有限公司)进行检测，严格按照说明书进行操作。

1.3 统计学处理:采用SPSS19.0软件对数据进行处理，两标本均数的比较采用t检验，P＜0.05为有显著性统计学差异。

2 结 果

表1 膀胱癌组与正常对照组、高危性膀胱癌组术前尿液中BLCA－4和IL－8水平的比较(±s)

表1 膀胱癌组与正常对照组、高危性膀胱癌组术前尿液中BLCA－4和IL－8水平的比较(±s)

与对照组相比，*P＜0.01;#P＜0.001

组别 BLCA－4(A/μg.protein)IL－8(ng/mL)正常对照组 2.7±5.8 12.3±7.9高危性膀胱癌组 9.1±18.7* 18.4±8.2*膀胱癌组 45.3±69.2# 36.6±11.5#

表2 术前尿液中BLCA－4和IL－8水平与膀胱癌临床病理特征的关系(±s)

表2 术前尿液中BLCA－4和IL－8水平与膀胱癌临床病理特征的关系(±s)

BLCA－4(A/μg.protein)IL－8(ng/mL)性别 男(n=26) 46.3±65.8 38.1±12.3 0.792 0.717肿瘤发生 单发(n=25) 40.3±56.8 32.8±10.6多发(n=17) 48.4±70.3 37.4±12.3 P 0.873 0.768年龄 ≤45(n=19) 45.1±70.2 34.7±11.3＞45(n=23) 47.4±68.3 37.5±12.6 P女(n=16) 44.7±67.2 35.9±13.4 P 0.101 0.132病理分期 T0 ～ T1(n=24) 46.2±57.3 37.7±13.3 0.073 0.085初发(n=23) 48.1±68.9 37.9±12.8复发(n=19) 42.7±61.3 32.4±11.7 P 0.325 0.271病理分级 G1(n=12) 33.7±56.8 26.4±11.7 G2(n=21) 42.2±63.7 33.1±12.2 T2 ～ T4(n=18) 44.6±60.5 35.3±12.6 P

G3(n=9) 48.1±66.3 38.8±11.3 P 0.023 0.037

2.1 膀胱癌组与正常对照组、高危性膀胱癌组术前尿液中BLCA－4和IL－8水平的比较:实验测得BLCA－4水平的 Cut－off值为 14.0A/μg.protein。其中膀胱癌组患者尿中BLCA－4含量显著性高于正常对照组和高危性膀胱癌组(P＜0.001)，而且高危性膀胱癌组为45.3±69.2A/μg.protein;正常对照组尿中 BLCA－4 含量为 2.7±5.8A/μg.protein;显著高于正常组(P＜0.01)。同时，与正常对照组相比，术前尿液中IL－8水平在高危性膀胱癌组和膀胱癌组均显著性上升，统计学差异分别为 P＜0.01，P＜0.001。见表1。

2.2 术前尿液中BLCA－4和IL－8水平与膀胱癌临床病理特征的关系:将膀胱癌组患者按照性别、年龄、肿瘤发生情况、肿瘤病理分期和分级等病理特征进行各自分组后统计分析发现，术前尿液中BLCA－4水平与年龄、性别、肿瘤单发还是多发，初发还是复发没有显著统计学差异(P均＞0.05)，但与肿瘤的病理分期和分级有显著统计学差异(P＜0.05)，同时IL－8水平的检测与BLCA－4水平的表达基本一致。见表2。

3 讨 论

BLCAs家族最早是在1996年由 Getzenberg等［5］利用双向凝胶电泳法从膀胱癌患者和正常人的膀胱组织中提取出来的。其中BLCA1－6是6种特异性表达于膀胱肿瘤而非正常人膀胱组织中的膀胱癌特异性核基质蛋白，除BLCA－5外，其余均表达于所有的膀胱癌细胞系中。BLCA－4具有组织特异性和疾病特异性，近年来随着对核基质蛋白的深入研究，BLCA－4成为具有潜在临床应用前景的膀胱肿瘤标志物。

目前关于BLCA－4功能分析的研究相比其他膀胱特异性核基质蛋白较多。其中Myers－Irvin等［6］通过将BLCA－4基因转染至四种不同人膀胱癌细胞系中分析发现:BLCA－4高表达的膀胱癌细胞中，白细胞介素－1α(IL－1α)、白细胞介素－8(IL－8)、血栓调节蛋白(TM)、血管内皮样因子(VEGF)及血清淀粉蛋白(SA)等许多细胞生长相关基因均上调，同时也伴有维生素D3相关基因下调。该研究说明BLCA－4的高表达可以引起许多基因表达的改变，其相互作用可能与肿瘤的发生、复发及进展有着密切联系。其中，IL－8作为一个多种细胞来源的趋化性细胞因子，可参与炎症反应、免疫应答及创伤愈合等过程，并且在肿瘤微环境中发挥重要作用。Myers－Irvin等［6］的芯片研究显示在BLCA－4转染的膀胱癌细胞系中IL－8含量增加了12倍，而同时Feng等［7］的研究也提示BLCA－4的高表达与IL－8的增加是同时的，Escudero等［8］证明 BLCA－4调控IL－8基因的上调，在尿路上皮细胞恶性转化和远处转移中起关键作用。以上结论均说明了BLCA－4与IL－8在膀胱癌形成中的潜在一致性，提示作为肿瘤标志物的可能。

对于BLCA－4或作为膀胱癌肿瘤标记物的研究已有很多文献报道，但结果略有差异。有报道采用用间接酶联免疫吸附测定法证明尿液BLCA－4水平在膀胱癌患者中显著高表达，且其表达水平与性别、年龄、疾病分期及分级无关。本研究对膀胱癌组患者、正常对照组和高危性膀胱癌人群中尿液中BLCA－4和IL－8分别进行检测，结果发现膀胱癌组患者术前尿液中BLCA－4和IL－8均显著高于正常对照组和高危性膀胱癌组，这与前人研究结果是一致的，而且我们还发现高危性膀胱癌组患者的BLCA－4和IL－8也显著高于正常对照组，不仅提示两者变化的同步性还说明两者联合应用于膀胱癌早期诊断的可能性［9］。此外，通过统计分析发现术前尿液中BLCA－4水平与年龄、性别、肿瘤单发还是多发，初发还是复发均无关，但与肿瘤的病理分期和分级有显著相关性，这与Zhao等免疫组化的结果是一致的。

［1］ 温登瑰，单保恩，张思维，等.2003年至2007年中国肿瘤登记地区膀胱癌的发病与死亡分析［J］.肿瘤，2012，32:256 ～262.

［2］ Julie M，Myers－Irvin，Thu－Suong Van Le and Robert H.Mechanistic analysis of the role of BLCA－4 in bladder cancer pathobiology［J］.Cancer Res，2005，65(16):7145 ～7150.

［3］ Shelley MD，Mason MD，Kynaston H.Intravesical therapy for superficial bladder cancer:a systematic review of randomised trials and meta－analyses［J］.Cancer Treat，2010，36:195 ～205.

［4］ 徐素粉，王艳玲，赵福涛.Fas/FasL与自身免疫性疾病［J］.医学综述，2011，17(7):969 ～971.

［5］ Getzenberg RH，Konety BR，Oeler TA，et al.Bladder cancerassociated nuclear matrix proteins［J］.Cancer Res，1996，56:1690～1694.

［6］ Myers－Irvin JM，Van Le TS，Getzenberg RH.Mechanistic analysis of the role of BLCA－4 in bladder cancer pathobiology［J］.Cancer Res，2005，65:7145 ～7150.

［7］ Feng C，Wu Z，Guo T，et al.BLCA－4 expression is related to MMP－9，VEGF，IL－1alpha and IL－8 in bladder cancer but not to PEDF，TNF－alpha or angiogenesis［J］.Pathol Biol(Paris)，2012，60:36～40.

［8］ Escudero－Lourdes C，Wu T，Camarillo J M，et al.Interleukin－8(IL－8)over－production and autocrine cell activation are key factors in monomethylarsonous acid［MMA(Ⅲ)］induced malignant transformation of urothelial cells［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2012，258(1):10 ～18.

［9］ 王彩军，陆东权，张龙等.围手术期吡柔比星膀胱灌注预防非肌层浸润性膀胱癌术后复发的对照研究［J］.临床和实验医学杂志，2014，13(16):1671 ～4695.