microRNAs在大肠癌诊断和预后中作用

王园园　谷体心　李冬　张丽静

microRNAs在大肠癌诊断和预后中作用

王园园谷体心李冬张丽静

【关键词】肿瘤，大肠;micro RNAs

【中图分类号】R 735.34

【文献标识码】A

【文章编号】1002－7386(2015)16－2510－03

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.16.038

收稿日期:(2015－03－30)

项目来源:河北省医学科学研究重点课题计划(编号: 20110284)，河北省自然科学基金项目(编号: H2014206313)

作者单位: 050031石家庄市，河北医科大学第一医院(王园园、谷体心、张丽静);河北医科大学2001级研究生(李冬)

microRNA是一类非编码小RNA分子，长度约18 ～25核苷酸，由基因自发转录产生，且作为调节基因表达的微小分子，负向调节靶基因表达。microRNA与其靶向的mRNA完全或不完全匹配结合，诱导mRNA降解或阻遏其翻译，从而影响靶蛋白的生物功能［1］。microRNA在包括大肠癌在内的多种癌症中存在异常表达，因此，microRNA有可能成为新的肿瘤标志物。目前，已经发现得microRNA大约有700多个。microRNA在正常组织和肿瘤组织中的表达存在差异，并且不同类型肿瘤间有不同的microRNA表达谱［2，3］。这些研究提示microRNA在肿瘤的发生中可能存在重要作用，检测特异性的microRNA表达变化可能成为发现早期癌症的重要手段，microRNA还可以用来预测癌症的预后，作为治疗效果的观察指标，甚至可能成为根治肿瘤的特效药物。本文就microRNA在大肠癌诊断和预后中的研究进展作一综述。

1　大肠癌的发病和检测情况

大肠癌是消化道常见的恶性肿瘤，全球每年约有123万人发病，每年约有60万患者死于大肠癌［4］。在欧美国家，随着对大肠癌普查手段的广泛应用，对结肠腺瘤病变及时给予切除，大肠癌发病率出现下降趋势。近年来，随着人口的老龄化和饮食习惯及结构的改变，我国大肠癌发病率出现了升高趋势。大肠癌的预后与其分期呈明显相关性，早期大肠癌通过手术治疗可以治愈，晚期大肠癌就预后很差，因此，如何发现早期大肠癌是提高大肠癌生存率的关键因素之一。大肠癌发病过程较为漫长，大多散发大肠癌患者经过从腺瘤到癌变的过程，这个过程甚至可以长达数年，这就为发现早期大肠癌患者提供了可能。但是早期大肠癌大多没有特异性临床表现，很少有早期大肠癌患者到医院就诊。目前对发现大肠癌最有效的手段是结肠镜检查，这种检查方法需要清洁肠道，属于一种侵入性检查，受检查比较痛苦，而且很多患者对结肠镜检查心存恐惧，拒绝行结肠镜检查。现有的实验室手段有血清CEA检测和粪便潜血试验，这两种方法对于大肠癌诊断特异性和灵敏度都较低，因此临床迫切需要新的肿瘤标志物来协助大肠癌早期诊断和监测。

2　将microRNA作为大肠癌肿瘤标志物的优势

寻找肿瘤标志物一直都是肿瘤研究的重要领域。肿瘤标志物在癌症的早期诊断、个体化治疗和预后判断等诸多方面都具有重要作用。一个良好的肿瘤标志物应该能够反映肿瘤的生长状态，在肿瘤的发生初期就有特异性升高，肿瘤控制后水平趋于稳定，根治性切除肿瘤后，肿瘤标志物应该迅速下降，肿瘤复发后，肿瘤标志物明显升高。目前，血清CEA水平是针对大肠癌诊断的常用肿瘤标志物。但是，血清CEA水平对大肠癌诊断的敏感性和特异性都不高。在这方面，microRNA是一种优秀的新型肿瘤标志物候选者。研究发现健康志愿者和大肠癌患者血清之间存在microRNA的表达差异［5］。虽然对于血清中microRNA的具体来源还不清楚，多数研究发现肿瘤组织中过表达的microRNA在血清中也升高，提示血清中过表达的microRNA可能是来源于肿瘤细胞。将microRNA作为癌

症的特异性诊断标志物还具有如下优势:(1)一个microRNA往往调节上百个mRNA表达，因此，从数百个microRNA中寻找癌症的特异性标志物要比从上万个mRNA中寻找癌症的特异性标志物相对容易。(2)由于microRAN片段较小并且存在颈环结构，因此其化学性质稳定，其表达水平不会因为标本固定和长时间保存等因素而影响检测结果。(3)可以用传统的杂交技术或免疫荧光杂交技术来确定microRNA在细胞内的表达部位。(4)microRNA广泛存在于体液中，尤其是在血液和粪便中的microRNA有可能成为很有价值的肿瘤标志物［6，7］。

3　血清microRNA在大肠癌诊断中的作用

Chen等应用高通量测序技术，发现大肠癌患者和健康志愿者血清中存在明显不同的microRNA表达谱。其中发现有69个microRNA只有大肠癌患者表达，正常健康志愿者不表达这69个microRNA。当然，在这些microRNA中只有一小部分可能成为大肠癌诊断的特异性标志物，因为，这69个microRNA中有相当一部分在其它癌症患者中也存在高表达［5］。Ng等［8］发现miR-92a在大肠癌患者血清中存在高表达。他们应用荧光定量PCR技术对90例大肠癌患者和50例健康志愿者血清miR-92a表达水平进行了比较，发现miR-92a可以作为大肠癌辅助诊断的一个指标，其诊断的敏感性为89%，特异性为70%。

Huang等［9］对100例大肠癌和59例健康对照组miR-92a表达水平进行检测，也得出了类似结果。同时Huang等［9］还发现miR-29a在大肠癌患者和健康志愿者之间存在明显的表达差异，miR-29a作为大肠癌的辅助诊断指标，其诊断特异性约为89.1%，敏感性为69%。上述研究还发现miR-29a和miR-92a表达水平与大肠癌的肿瘤分期无关。

最近，Toiyama等［10］对186例大肠癌患者，43例大肠腺瘤患者和53例健康志愿者的血清microRNA21表达水平进行了检测，发现血清microRNA21与大肠癌组织中的micoRNA表达成平行关系，大肠癌行根治手术后血清microRNA21表达水平明显下降。在大肠癌、大肠腺瘤和健康志愿者之间，血清microRNA21表达水平存在显著差异，研究认为血清microRNA21可以作为大肠癌早期诊断肿瘤标志物［10］。

4　粪便microRNA在大肠癌诊断中的作用

正常大肠黏膜细胞和发生肿瘤的大肠黏膜细胞每天都进行更新，脱落的大肠细胞随大便排出，这些脱落细胞中携带有丰富的遗传信息，而多数大肠癌发生是一个渐进的过程，因此，从理论说，通过对脱落细胞进行DNA、RNA、蛋白和microRNA的检测可以协助发现早期大肠癌。

microRNA性质稳定，不像蛋白和信使RNA那样容易发生降解，因此，通过检测microRNA在粪便中的表达水平可以协助发现早期大肠癌。但是，粪便中大部分microRNA是食物来源的，人源性microRNA在粪便中只占有很小的比例，约占2%，如何去除食物来源的microRNA对诊断的干扰是需要解决的首要问题。通过改进大便标本的准备方法，RNA制备方法，现在已经有商业化试剂盒可以获得高纯度的大便RNA标本来用于microRNA检测。Ahemd等［11］对粪便microRNA作为大肠癌肿瘤标志物的可能性进行了研究，他们首先应用芯片技术对处于不同分期的大肠癌患者和健康志愿者粪便microRNA水平进行了比较，发现有202个microRNA表达水平有明显差异，其中141个microRNA在大肠癌患者中表达升高，61个microRNA表达水平下降。对其中变化较大的20个microRNA进行了定量研究，确定12个microRNA(miR-7，miR-17，miR-20a，miR-21，miR-92a，miR-96，miR-106a，miR-134，miR-183miR-196a，miR-199a-3p，miR-214)在大肠癌粪便中明显升高，其升高水平反映了大肠癌肿瘤中microRNA变化，认为可以将粪便microRNA检测作为大肠癌诊断的肿瘤标志物［11］。

5　microRNA在大肠癌治疗和预后中的作用

尽管随着外科手术技巧的提高，可以对很多以前不能手术的大肠癌患者进行根治性手术，但是仍有相当一部分患者会出现局部复发和远处转移。临床上也有相当一部分大肠癌患者对化疗不敏感。临床医师需要应用可靠的肿瘤标志物来判断患者对治疗的反应，估计患者的预后。microRNA可以判断大肠癌患者预后，指导临床治疗。

Pu等［12，13］用定量RTPCR方法对103例大肠癌和37例健康志愿者血浆microRNA21，microRNA221，microRNA222进行了比较，发现血浆microRNA221与大肠癌预后明显相关，microRNA221升高患者预后不良。Tsai等［14］发现血清microRNA148a降低大肠癌患者容易发生早期复发，microRNA148a降低是大肠癌预后不良的分子标志物。

Qian等［15］研究发现microRNA-143在大肠癌肿瘤组织和血清中表达降低，在体外实验中增高microRNA-14的表达水平，可以抑制大肠癌细胞生长，并且增强奥沙利铂多大肠癌细胞的杀伤作用。

目前认为肿瘤干细胞是肿瘤复发的种子细胞，Yu等［16］发现大肠癌肿瘤干细胞高表达microRNA21，在

细胞系中下调microRNA21的表达可以诱导类似的肿瘤干细胞分化，耐受化疗药物的大肠癌细胞对化学药物再次敏感。

6　microRNA常用检测手段及存在的问题

到目前为止，检测microRNA的常用方法有: northern印迹，cDNA芯片技术，Solexa测序，应用磁珠的流式细胞术和RT-PCR技术。microRNA片段很短，最多只有25个核苷酸，并且有些microRNA之间只存在单个核苷的差异，因此用标准的寡核苷酸很难获得特异性扩增。可喜的是通过锚定核酸技术可以解决这个问题，锚定核酸探针可以获得很好的特异性。cDNA芯片技术常用于高通量的microRNA检测，它可以同时对数百个microRNA同时进行检测，多用于microRNA的筛查，用该方法检测便捷、高效，但是检测的阳性结果，仍需要用northern印迹或RT-PCR技术来进一步证实，防止假阳性。RT-PCR技术是目前监测microRNA的常用手段，这种监测方法敏感、没有放射污染，同时可以做到相对定量监测，但是，这种方法也存在一些不足，因为应用不同的内参照物，可能会得出不同的监测结果，现在通常建议用多个内参照物来监测来弥补其缺陷。目前常用的内参照物有let-7A，miR-16，miR-26a，miR-345，miR -425和miR -454［17］。

microRNA的异常表达在大肠癌发病和进展的多个环节发挥了重要作用，多种在肿瘤组织中异常表达的microRNA在血液中也存在异常表达，而且这种表达异常存在平行。随着，microRNA检测技术水平的提高，通过对大样本人群的前瞻性研究，有望在不久的将来发现对大肠癌有指导意义的microRNA肿瘤标志物。

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