盾叶薯蓣中薯蓣皂苷元的含量测定与提取方法研究

雷震　魏晋宝　杨光义　钱秋霞　叶方　张晨宁　雷攀

盾叶薯蓣中薯蓣皂苷元的含量测定与提取方法研究

雷震魏晋宝杨光义钱秋霞叶方张晨宁雷攀

【关键词】盾叶薯蓣;薯蓣皂苷元;含量测定;提取方法;研究概述

【中图分类号】R 195

【文献标识码】A

【文章编号】1002－7386(2015)17－2671－05

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.17.040

项目来源:湖北省科学技术研究与发展支撑计划(对外科技合作类)项目(编号: 2013BHE017)

作者单位: 442000湖北省十堰市，湖北医药学院附属十堰市太和医院(雷震、魏晋宝、杨光义、叶方、张晨宁);湖北医药学院药学院(钱秋霞);湖北中医药大学(雷攀)

通讯作者:杨光义，442000湖北省十堰市，湖北医药学院附属十堰市太和医院;

E-mail: ygy996@163.com

盾叶薯蓣又名黄姜、火头根，分类学上隶属于单子叶植物百合目、薯蓣科、薯蓣属，根状茎组，多年生缠绕草质藤本植物［1］。盾叶薯蓣是我国特有的药用植物，广泛分布于我国的湖北、陕西、河南、湖南等地，尤其是湖北和陕西两省的种植面积最大，占到全国的70%［2］。从盾叶薯蓣中提取的皂苷元是生产甾体类激素和甾体类避孕药的工业原料，世界上约2/3的甾体激素药物是以薯蓣皂苷元作为基础原料来合成的，因此，薯蓣皂苷元在甾体激素类药物生产中具有十分重要的地位［3］。研究发现薯蓣皂苷及其衍生物具有抗病毒、抗肿瘤、改善血管内皮细胞功能、抗炎、降血脂、抗艾滋病等药理作用［4－8］。目前，在工业上常用酸水解法来提取盾叶薯蓣中的皂苷元，这不仅会对环境造成严重的污染，且提取效率较低。所以，开发洁净的皂苷元提取工艺是保护环境的迫切需要，而皂苷元的含量测定方法是工艺开发、优选及改进的重要评价指标。本文将对盾叶薯蓣中皂苷元的传统及新开发的提取工艺及含量测定方法进行总结，以期对盾叶薯蓣中皂苷元的生产工艺改进、质量标准制定及质量控制提供参考文献。

1　薯蓣皂苷元含量测定方法

薯蓣皂苷元的测定方法是评价工艺条件和提取方法、品种优选、药效比较的一种重要工具。薯蓣皂苷元的测定方法有重量法和薄层扫描法等方法，后来发展的分光光度法、气相色谱法、高效液相色谱法，以及应用较新的酶联免疫吸附法等方法，它们在含量测定中有各自的特点，在具体的运用中要根据实际情况针对每种方法的优缺点进行选择。

1.1重量法重量检测法由于其操作直观，易于掌握，从20世纪50年代末一直沿用至今。重量法有两种方法:(1)先经多次重结晶合并结晶后再称取总重量计算植物中的薯蓣皂苷元［9］;(2)先用石油醚提取皂苷元，将其浓缩干燥至恒重后，称得浓缩物和瓶的总重(G1)，再将薯蓣皂素溶于乙醇，将瓶洗干净后烘干至恒重，称得瓶重(G2)，两者之差就是薯蓣皂苷元的重量。重量法原理简单，设备要求不高，只需称重即可，但测定误差大，在工厂中主要用于粗略分析。

1.2薄层色谱法(TLC)TLC法是将一定波长的单色光垂直照射展开后的薄层板，测定薄层色谱斑点的吸收度随展开距离的变化，所得关系曲线下的面积与色谱斑点的中待测物质的浓度或量成正比，这种定量分析方法称为薄层扫描法［10］。王菊凤等［11］采用TLC法和RP-HPLC法对在生长光强为1.5、10、30、55、100、270 μmol·m－2·s－1下的弱光生态型盾叶薯蓣的薯蓣皂苷元和生物量分别进行测定，以探讨不同光强与盾叶薯蓣中薯蓣皂苷元和生物量的关系，并找出弱光生态型盾叶薯蓣的最适生长光强，并得出结论，弱光型盾叶薯蓣是一种薯蓣皂苷元量较高的薯蓣变种，这将为该药源植物的选择育种以及栽培提供理论指导。TLC可同时对多种复杂的样品进行分离和测定，简便快速、专属性好，但测量误差较大，一般多用于定性检测。

1.3分光光度法分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。薯蓣皂苷元与显色剂作用而形成共轭，导致最大吸收波长红移至530 nm处，而其他甾体皂苷元无此结构，从而得以分离测定。陈战国等［12］采用此法对盾叶薯蓣中的薯蓣皂苷元含量进行测定。王雷［13］也用此法测量了酸解溶液中薯蓣皂苷元的含量。分光光度法具有操作简单、消耗费用低等优点，并且皂苷元提取后不需分离精制即可直接测定在一定程度上具有专属性好、灵敏度高、重现性好等优点，与高效液相色谱法(HPLC法)相比，分光光度计法不需要中和溶液，测量速度快、试验成本低，但实验步骤繁琐。

1.4 HPLC法HPLC以液体为流动相，采用高压输液系统，将流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的定量及定性分析。谢彩霞等［14］通过RP-HPLC法测定薯蓣皂苷元的含量，并对含水量、生长年限、产地及土壤类型与薯蓣皂苷元含量的相关性进行研究，确定了影响盾叶薯蓣中有效成分含量的因素，以更好地控制其质量。葛芝红［15］采用HPLC法进行定量检测的研究，对盾叶冠心宁片质量标准进行了以薯蓣皂苷元为指标成分的含量测定方法研究，建立了增加盾叶冠心宁片含量测定方法的新质量标准。HPLC法与气相色谱法相比，使用范围广，流动相选择性大，层析柱使用寿命长，流出组分易收集，样品净化预处理过程简单，可同时分离测定多种物质。

1.5气相色谱法(GC)GC是利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异来实现混合物的分离。都述虎等［16］应用毛细管GC测定了薯蓣总皂苷中薯蓣皂苷元的含量，该法与HPLC相比，样品无须衍生化，分离效果好，且对薯蓣总皂苷中薯蓣皂苷元的含量测定方法进行了有益的探索。GC法对于组分多的混合物，既可分离又能提供定量数据，迅速方便，精密度好，此法比较适于中药及中成药中挥发性复杂成分分析［17］。

1.6酶联免疫吸附法(ELISA)酶联免疫吸附试验是一种固相免疫测定技术，其先将抗体或抗原包被到某种固相载体表面，并保持其免疫活性，让抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测，且颜色的深浅可作为判定抗原含量的依据［18］。ELISA法最早是由Engvall 在1971年用碱性磷酸脂酶标记的的gIC。随后该法得到了不断地完善。后来经过不断的发展，该法被首次应用于薯蓣皂苷元的含量测定中［18］。ELISA灵敏度很高，是HPLC的几百倍，检测所需的样品量少，效率高，处理量大，尤其适用薯蓣皂苷元等甾体激素类物质的检测。但是该法仍然有一些不足，如制作手续相对复杂，保存期较短，市场上没有检测薯蓣皂苷元试剂盒。

2　薯蓣皂苷元提取方法

薯蓣皂苷元是异螺旋甾烷的衍生物，能溶于甲醇、石油醚、环己烷等有机溶剂。在植物体内与糖链或纤维素结合形成苷键，并与细胞壁紧密结合。由于细胞壁比较坚韧，很难从植物原料中彻底分离提取出薯蓣皂苷元，要提取皂苷元首先要将薯蓣皂苷与细胞壁分离，然后再断开苷键使皂苷元游离出来，最后再进行提取。目前常用的提取工艺有直接酸解法、酶解法、生物转化法、超临界流体萃取法、超声提取法、热压分解法、微波萃取法、分离法等。

2.1直接酸解法直接酸水解法是在盾叶薯蓣根茎的粗粉中加入稀酸(稀硫酸或稀盐酸)进行水解，断开苷键使薯蓣皂苷元变成游离态，然后用提取剂将薯蓣皂苷元从酸解后的盾叶薯蓣中提取出来。宋子言等［19］采用硫酸水解-溶剂提取的方法得到皂苷元。酸解法虽然简单但是存在诸多缺点:当用盐酸水解时常常会产生羟基氯代反应;在酸性条件下薯蓣皂苷元易脱水发生转换;盾叶薯蓣根茎坚硬含有大量的淀粉和纤维素，薯蓣皂苷水解的不彻底造成皂苷元收率降低，浪费了大量的原料;酸水解后经大量水冲洗过程中产生大量废液污染环境;酸水解的过程剧烈破坏了薯蓣中的淀粉和糖，不利于资源综合利用;生产过程中选择汽油作为提取溶剂，其为易燃易爆物品为提取带来一定危险。

2.2酶解法

2.2.1直接酶解法:直接酶解法是利用从植物或微生物中得到的相关酶催化水解天然底物从而得到目标产物的方法。周振起等［20］用糖化酶和液体曲酶作用于盾叶薯蓣的根茎使薯蓣皂苷元与糖(纤维素)连接的皂苷键断裂，促进薯蓣皂苷元的游离，皂苷元的得率达到4%。王亚南等［21］比较了细菌发酵法、真菌发酵法和酶解法三种转化薯蓣皂苷成为皂苷元的方法，发现其中用直接酶解法进行酶反应定向转化的效果最佳，转化效率高达95%。直接酶解法操作简单、效率好且避免了传统酸水解造成的环境污染问题，但由于成本昂贵，很难应用于工业化生产。

2.2.2梯度生物酶解法:梯度生物酶解法就是在酸水解之前依次加入纤维素酶和果胶酶复合酶制剂、淀粉酶、以及糖化酶等来对盾叶薯蓣进行处理的技术。薯蓣皂苷元在植物体内与纤维素等结合存在于细胞壁上，细胞壁比较坚硬不利于皂苷元的溶出，用酶处理后可以温和的将“束缚”慢慢解除，有利于皂苷元的提取。张裕卿等在盾叶薯蓣粉末中依次加入纤维素酶和果胶酶复合酶制剂、淀粉酶以及糖化酶先进行酶催化反应，然后加入H2SO4水解，最后用索氏回流提取得到皂苷元。该研究结果表明梯度生物酶解法所得皂苷元的收率为2.79%，并能将植物中98%的薯蓣皂苷元提取出来［22］。酶处理可以减小药材包裹薯蓣皂苷的屏蔽作用，降低其空间位阻，减少酸用量，能够最大限度的将薯蓣皂苷水解成皂苷元，提高收率，但是仍然无法避免酸水解带来的环境污染问题。

2.2.3复合酶解法:复合酶解法是在酸水解之前，在盾叶薯蓣粉末中加入酶的复合制剂来对盾叶薯蓣进行预处理，从而减小淀粉、纤维素、糖类等物质对盾叶薯

蓣中皂苷元的提取造成的阻碍的方法。罗娜［23］用复合酶解法提取皂苷元并得出其最优条件:酶解时间16 h，酶解温度35℃，酶解pH值为5.0，酶用量40 U/g时，且与直接酸解法、自然发酵法比较得出复合酶解法皂苷元收率明显提高。刘国际等［24］比较了复合酶法、纤维素酶法、淀粉酶法、糖化酶法的提取效果，研究结果表明纤维素酶法提取出的皂苷元纯度最高，复合酶法提取的皂苷元收率最高。徐升运等［25］采用淀粉-纤维素复合酶法提取盾叶薯蓣皂苷元，薯蓣皂苷元收率提高26%。复合酶解法具有污水排放减少、皂苷元得率高、产品纯度高等优点，是一项清洁生产工艺，具有较好应用前景。

2.3微生物转化法

2.3.1预发酵法:预发酵法又叫自然发酵法，是先在自然条件下利用植物体本身和环境中的微生物代谢产生的胞外酶来使苷键断裂，淀粉、纤维素等部分水解，植物疏松，再进行酸水解提取薯蓣皂苷元的方法。该方法不需要接入菌种，同时不仅显著提高了皂苷元的收率，还缩短了水解时间。20世纪80年代，四川生物研究所薯蓣综合利用组的研究人员通过实验也证明了这一点［26］，在常规的酸水解之前进行原料自然发酵处理，穿龙薯蓣的收率能提高54%，盾叶薯蓣的收率可以提高40%。虽然预发酵法可以提高盾叶薯蓣的收率，但是该方法在工艺过程中仍存在诸多问题:多种微生物共同发酵，体系内内酶种类复杂随着发酵时间的延长，杂质的含量会增多，产品熔点降低从而影响提取的效果;随季节环境等的变化，酶反应条件不好控制，会造成产物质量和收率的差异;工艺过程中的废水的产量并没有降低，对环境的危害仍然存在;淀粉、糖等物质还是没有得到综合利用。

2.3.2微生物直接转化法:微生物直接转化法就是先选择可以将盾叶薯蓣中的薯蓣皂苷直接转化为皂苷元的微生物直接接种于原料中，进行培养和发酵，最后得到薯蓣皂苷元的工艺。早在2008年，已有相关研究人员采用微生物发酵的方法来获得盾叶薯蓣中的皂苷元［27］。董悦生等［28］利用米曲霉进行微生物直接转化，薯蓣皂苷元得率可达17.06 mg/g，是粗酶液转化的6.77倍，该工艺转化过程中甾体的总摩尔数是微波辅助提取和酸水解的1～2倍。该工艺中微生物产生的酶具有一定的专一性，有利于有效成分的溶出，成本较低，发酵工艺成熟便于工业化生产，摒弃了酸水解过程带来的环境污染问题，是一项洁净的生产工艺。

2.4超临界流体萃取法超临界流体萃取法是近些年新兴的提取方法之一，是将超临界流体作为萃取剂将一种物质从混合物中提取出来的方法，通过超临界流体的溶解能力与其密度的关系进行提取分离，因CO2临界点低、无毒、不易挥发、化学性质稳定、容易从萃取体系中除去，所以CO2是常用的萃取剂。李水清等［29］用超临界CO2萃取盾叶薯蓣酸解后粗品中的薯蓣皂苷元，过程中以乙醇作夹带剂，萃取压力30 MPa，萃取温度50℃，萃取时间2 h，皂素提取率为89.4%，而一般索式回流提取法的皂素提取率为77.2%。王凤芝等［30］对比了常规酸水解法和先酸解后超临界CO2萃取法的不同，发现常规酸水解法薯蓣皂苷元的得率为0.622%，而超临界CO2萃取后薯蓣皂苷元的得率可达1.226%。超临界流体萃取系统具有较快的传质和萃取速度，与传统的中药提取分离技术相比超临界流体萃取法具有工艺简单，皂苷元收率高，提取周期短，萃取技术具有对原料成分无破坏，避免了易燃易爆有机溶剂汽油等优点。但超临界流体萃取萃取仅仅是从水解物到薯蓣皂苷元的提取过程中生产工艺的改革，需要在高压的条件下进行，对设备要求高投资费用大，产量不稳定，没有对盾叶薯蓣综合利用。因此，该法并没有普遍应用于工业生产。

2.5超声提取法超声提取法是利用超声波的强振动、强搅拌作用和强空化效应，来加速中药材中目标成分的溶出并充分与溶剂混合常用于超声波辅助酸解法和直接超声法提取皂苷元。郭锦明等［31］探讨在95%乙醇溶液中，采用超声法直接提取盾叶薯蓣皂苷元，不再进行酸解。结果显示，功率为300 kHz、提取时间为30 min最适宜;皂苷元提取率较一般回流法明显提高，提取时间显著缩短。张黎明等［32］将10 g盾叶薯蓣粗粉，于固液比为1∶10(g∶ml)的70%乙醇溶液中，在功率100 W条件下超声提取2次，每次30 min，再进行酸解，薯蓣皂苷元得率2.570%，发现超声处理对盾叶薯蓣中薯蓣皂苷元的溶出，以及对薯蓣总皂苷的苷键裂解都有显著效果。与常规的各种酸解法相比，超声波辅助酸解法先对原料进行超声处理，破坏原料细胞组织结构，再进行酸解，具有得率高、时间短、能耗低等优点，但是仍然会对环境造成污染，也不利于资源综合利用。然而，直接超声提取法可以直接断裂皂苷键，过程中避免了酸的使用，可以解决环境污染的问题。

2.6热压分解法热压分解法是由刘国际等［33］首次提出并申请了国家专利。该工艺是在高温高压条件下使薯蓣皂苷元与糖之间的苷键断裂，游离出皂苷元，其工艺流程为:将盾叶薯蓣粗碎成小块置于饱和蒸汽压下充分处理，然后将物料进行干燥、粗碎，再用石油醚进行提取得到皂苷元。陈俊英等［34］研究了影响热分

解的各种影响因素，结果表明在饱和蒸汽压力1.4 MPa，保压时间30 min，加料量为负载的85%的条件下薯蓣皂素的收率为1.745%。该工艺与传统方法比较，二者萃取率相当，但传统酸解法生产时产生大量的废液对环境造成严重的污染，而热压分解法则省去了酸解过程，完全避免了酸水带来的环境污染问题，且生产周期短、耗能低，是一种具有广阔应用前景的清洁工艺。

2.7分离法分离法是根据淀粉和纤维素难溶于水，而薯蓣皂苷可溶于水的性质将薯蓣根茎带水磨碎、过虑、分离出纤维渣，静置沉淀分离淀粉后，再提取皂苷元的方法。刘国梁等［35］对盾叶薯蓣进行了分离处理，经检测发现薯蓣皂苷元仅存在于悬浊液部分。陈合等［36］通过对酶解-酸水解法、预发酵-酸水解法、分离-发酵-酸水解法、分离-酸水解法等提取皂苷元的工艺进行比较，发现分离法皂苷元的平均得率为传统方法的86.56%，但用酸量仅为传统方法的9.62%，同时分离得到46.44%的纤维素和32.75%的淀粉，有效实现了资源综合利用。分离法能预先除去纤维素和淀粉以节省化工原料、动力和劳力，同时综合利用纤维素和淀粉，但工艺流程长，生产中需耗费大量的水，且该工艺对设备要求较高，投资过大，在工业生产中限制了其广泛应用。

2.8微波萃取法微波萃取法是将微波的能量传递到溶剂及细胞中，细胞内部升温，压力变大，细胞壁破裂，皂苷元流出。李谦等［37］对比了微波和水浴两种不同的加热方法下盾叶薯蓣皂苷元的水解效率，其中微波法水解的时间为水浴的8%，盐酸用量减少50%，皂苷元的得率提升20%。刘琳等［38］比较了回流、冷浸渍、索氏提取和微波辅助双水相提取4种方法的提取效果，结果表明微波辅助法提取皂苷元的提取率仅次于索氏提取法。舒明勇［39］采用微波萃取法提取薯蓣皂苷元，实验发现当提取条件是固液比1∶20，提取时间10 min，提取温度100℃，粒度60目时，经高效液相色谱法检测得率可达1.837%。微波萃取法选择性高、提取时间短、提高了薯蓣总皂苷的溶出率及有效成分的得率。

薯蓣皂苷元药理作用明显、用途广泛，已经有越来越多的学者对其提取工艺进行了研究，更多的新技术和方法将被运用于薯蓣皂苷元的提取和含量测定中。本文对盾叶薯蓣中皂苷元提取方法和含量测定方法进行了归纳总结。目前，工业上的薯蓣皂苷元大多还是酸解法提取的，但是该工艺提取率低、提取周期长、不利于资源综合利用还会对环境造成严重污染。虽然改进后的酸工艺对提取工艺进行了优化，但是仍然不能避免废液对环境造成的污染问题。研究发现分离法可以极大减少酸的用量且能综合利用淀粉和纤维素，但是该工艺提取的皂苷元得率较低，限制了其应用。近年来开发的新工艺热压分解法完全避免了酸的使用，但该工艺仍然处于试验阶段，还没有用于工业生产。此外，生物技术的在皂苷元生产工艺中的应用越来越受到重视，比如酶解法及微生物转化法，这些新技术不仅高效且环境友好。因此，开发出对环境友好、皂苷元得率高、资源综合利用率高、工艺周期短的新工艺是将来工艺研究改进的主要方向。与此同时，随着薯蓣皂苷元的用途不断被发现，其用量也与日俱增，这些选择性高、稳定性好、准确快速且对皂苷元工艺条件、提取方法及不同盾叶薯蓣品种可以进行优择及评价的新含量测定方法在盾叶薯蓣皂苷元的研究中将发挥巨大的作用。

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