NMDA-NR2B亚基受体与神经病理性疼痛的研究进展

李欢颜，阳巧云，彭良玉，旷 昕

(南华大学附属第一医院麻醉科，湖南 衡阳 421000)

·综 述·

NMDA-NR2B亚基受体与神经病理性疼痛的研究进展

李欢颜，阳巧云，彭良玉，旷 昕

(南华大学附属第一医院麻醉科，湖南 衡阳 421000)

NMDA受体是一种谷氨酸离子型受体，在兴奋性突触可塑性中起着重要作用。现已证明NMDA-NR2B亚基受体参与学习记忆、慢性疼痛、局部缺血和神经退行性疾病。NR2B亚基诱导长时程增强（LTP）的产生在中枢敏化及神经病理性疼痛性的形成中起着重要的作用，NR2B受体拮抗剂可以有效的治疗神经病理性疼痛。本文就NMDA-NR2B亚基受体与神经病理性疼痛的研究做一综述。

NR2B亚基；NMDA受体；神经病理性疼痛

神经病理性疼痛是由于神经系统损伤或者功能失调而引起的疼痛，可被分为外周神经病理性疼痛和中枢神经病理性疼痛。神经病理性疼痛会导致长期痛苦和生活质量下降，但是治疗后只有少数患者痛苦得以减轻，对于患者和医疗工作者的治疗都是一个巨大挑战[1-2]。近年来随着对疼痛的深入研究，中枢敏化被认为在神经病理性疼痛的发展和维持中起重要作用，而NMDA-NR2B亚基受体在疼痛传递和突触可塑性上成为治疗神经病理性疼痛的重要靶点[3]。本文主要介绍NMDA-NR2B亚基受体结构功能和在神经病理性疼痛发生中的机制以及治疗前景。

1 NMDA-NR2 B亚基受体的结构功能

1.1 NMDA受体结构分布 NMDA受体是一种谷氨酸离子型受体，在兴奋性突触可塑性中起着重要作用[4]。NMDA受体有3种成分结构不同的亚基复合物：8个不同的NR1亚基由单个基因选择性剪接产生；4个不同的NR2亚基(NR2A、NR2B、NR2C和NR2D)和2个NR3亚基(NR3A和NR3B)由6个独立基因编码。功能性NMDA受体包括异源NR1亚基加上一个或多个NR2A-D亚基，最常见的包括两个NR1亚基与相同或不同的两个NR2亚基。NR1亚基分布在中枢神经系统任何位置；而NR2亚基局限性分布并且数量表达与发育相关，NR2A位于脑和脊髓，NR2B位于前脑和脊髓浅表板层[5-6]。

1.2 NR2B亚基结构功能 NR2B亚基是一种膜蛋白，分子量为170～180 kD。它由四个不同调节单位组成：细胞外有两大区域，氨基端结合域(NTD)和结合谷氨酸的S1-S2激动剂结合域(ABD)；跨膜区域包括三个跨膜片段和一个折返环路，形成离子通道并且类似一个倒置的K+通道；羧基端胞质区是结合蛋白激酶的磷酸化位点，例如PKC和酪氨酸激酶等[7]。在早期发育阶段，含有丰富的NR2B，但随着年龄的增加而逐渐下降，并且受限于前脑，包括皮层、海马、纹状体、丘脑和嗅球[8]。NR2B亚基参与机体的生理功能，例如学习、记忆；同时参与病理生理疾病，如慢性疼痛、局部缺血和神经退行性疾病[9]。含有NR2B亚基的NMDA受体具有如下特点：(1)对Ca2+有高度通透性；(2)对谷氨酸有较高的亲和力[4]；(3)由其介导的兴奋性突触后电位(EPSPs)增加明显；(4)与胞内的钙调蛋白激酶CaMKⅡ的亲和力较高[10]。

2 NR2 B亚基在神经病理性疼痛发生中的机制

中枢敏化为在刺激、炎症和神经损伤后疼痛通路中神经元功能增加，突触后膜兴奋性和突触效能增加，同时躯体感觉神经元突触可塑性增强[3]。NMDA受体激活在脊髓背角中触发中枢敏化是必不可少的，特别是NR2B亚基[4]。而NR2B亚基调控神经病理性疼痛的机制是由多重因素组成的，因此必须明确神经病理性疼痛和NR2B亚基的调节机制。

2.1 NR2B亚基与LTP Qu等[11]结扎SD大鼠L5脊神经背角神经根远端后，在鞘内注射NR2B拮抗剂Ro25-6981后热敏和机械敏下降；电生理学结果显示WDR神经元电活动被抑制。同时有研究证明脊髓背角GABA能神经元去抑制后NR2B亚基表达增加[12]。因此，通过脊髓背角伤害性突触传递诱发的LTP，进而导致中枢敏化和神经病理性疼痛与激活脊髓NMDA-NR2B亚基受体有关。NMDA受体诱导LTP的主要机制是它的电压依赖性。在静息电位时NMDA受体处于非活动状态，为了激活突触上的NMDA受体，首先谷氨酸需要被释放，并结合于NMDA-NR2B亚基受体；第二，突触后膜需要去极化，使得细胞外的Mg2+移除。NMDA受体介导的Ca2+从细胞外进入突触后细胞，然后释放一系列突触后信号分子[13]。NR2B亚基含有环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB），可耦合增加的Ca2+，当大量Ca2+从细胞外内流时导致细胞外调节蛋白激酶(ERK)磷酸化，从而激活CREB调节转录因子[9]；同时内流的Ca2+与调钙蛋白（CaM）结合使CaM磷酸化，激活突触后膜AMPAR，使更多的Ca2+内流[4]。因此耦合和内流增加的Ca2+形成正反馈加强NR2B功能进一步诱导LTP。

2.2 NR2B亚基与突触后密度(PSD)PSD95是膜-相关鸟苷酸激酶(MAGUKs)家族中的一员，包括N末端三个PDZ区域，中间区域一个Scr同源区3(SH3)和C末端一个鸟苷酸激酶样(GK)区域。其中第二个PDZ区域在C端含有一个PDZ结合基序(tSXV)，可以结合NMDA-NR2B亚基，从而介导NMDA受体功能；PSD-95还能结合多种信号分子从而激活下游信号级联。PSD-95同时含有网架结构，可以锚定和集合突触后谷氨酸受体并将Fyn激酶带到底物NR2B附近，在突触可塑性和神经发展中有重要作用[14-17]。Ba等[16]在左旋多巴引起的运动障碍(LID)大鼠纹状体内注射PSD-95mRNA反义寡核苷酸(PSD-95 ASO)，免疫印迹和免疫沉淀的结果显示NR2B酪氨酸磷酸化减少并且减弱NR2B与Fyn反应；此结果说明抑制PSD-95下调NMDAR激活同时对LID有治疗作用。有实验证明，向鞘内注射模拟肽Myr-NR2B9c干扰PSD-95和NR2B反应，从而减轻骨性癌痛[18]。无论NR2B还是PSD-95都分布在脊髓灰质，分布最密集的地方在表面板层，因此他们是接收终端伤害感受器的理想位置[19]。PSD-93也是膜-相关鸟苷酸激酶(MAGUKs)家族中主要成员,含有PDZ、SH3、GK三个区域。PSD-93通过PDZ区域在突触后密度特异性结合NMDA受体C端，是耦联NMDA激活的特定细胞内重要信号分子[20]。近来，Zhang等[21]观察PSD-93敲除(KO)小鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)后，TTC染色结果显示梗死面积明显减少；Western blot结果显示Tyr1472-NR2B磷酸化减少并且影响NR2B和Fyn相互作用。也就是说PSD93缺失抑制Fyn介导的NR2B磷酸化并且保护局部脑缺血。同时在SD大鼠体内研究中，干扰PSD-93已被证明在减轻外周损伤引起的神经病理性疼痛和CFA引起的炎性疼痛[22]。

2.3 NR2B亚基磷酸化 NR2B亚基羧基端主要作用是翻译后酶的修饰，如磷酸化[7]。磷酸化调控许多细胞过程，包括蛋白活性、定位、流动性和蛋白相互作用[9]。Xu等[23]证明在持续炎症性反应(CFA)后磷酸化NR2B在总NR2B的比例明显增加。Luo等[24]发现肠易激综合征(IBS)大鼠脊髓背角NR2B亚基表达量增加，在鞘内注射酪氨酸激酶抑制剂后显著下降。因此，NR2B亚基激活是由酪氨酸磷酸化调控，同时在神经病理性疼痛中由酪氨酸引起NR2B亚基磷酸化是中枢敏化的重要机制。现有许多丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点已在NMDA受体亚单位被确定，例如：PKA、PK、CaMKII，这些激酶可以调控NMDA受体细胞内运输或者离子通道特性，造成突触强度变化引起多种形式突触可塑性[25]。NR2B亚基的具有7个位于突触后密度(PSD)的酪氨酸磷酸化位点，Tyr1472是主要的磷酸化位点。Y1472含有酪氨酸基础内在基序(YEKL)，直接与AP-2适配器中链结合。NR2B亚基Y1472磷酸化后中断其结合，由此抑制NR2B介导的内吞作用[9，26]。Abe等[27]在L5脊神经断离小鼠脊髓免疫荧光结果中发现在Ⅰ、Ⅱ板层pY1472-NR2B明显增加，而口服NR2B拮抗剂CP-101，606后接近于正常水平；并且在Fyn基因敲除小鼠术后，免疫荧光显微镜下几乎无pY1472-NR2B。因此，Fyn激酶激活NR2B亚基Tyr1472磷酸化对维持神经病理性疼痛是必不可少的。最近的研究表明，酪氨酸磷酸化的NR2B亚基由STEP(富含酪氨酸酶纹状体)控制，STEP对亚基在Y1472上有去磷酸化作用，增加NMDA受体内吞[28]。

2.4 NR2B亚基棕榈酰化 除了磷酸化，另一种蛋白修饰类型是调控蛋白定位和功能，称为修饰后棕榈酰化。由半胱氨酸残基的硫酯键共价结合棕榈酰蛋白，与磷酸化相似的，这种修饰是不稳定和可逆的。棕榈酸是一个含有饱和脂肪酸的16碳，是大脑中最丰富的脂肪酸[29-30]。NR2A和NR2B棕榈酰在皮质神经有两种不同的半胱氨酸群：棕榈酰化近膜区域的第一簇(Cys ClusterⅠ)，控制表面NMDA受体稳定表达和其内在结构并且在细胞表面稳定调控NR2A/ B酪氨酸磷酸化；第二簇(Cys ClusterⅡ)在C末端中间区，由棕榈酰转移酶GODZ棕榈酰化，去棕榈酰化是由于受体在高尔基体聚集并减少表面NMDA受体表达[31]。Xia等[32]证明在慢性背角神经根压迫模型(CCD)过程中NR2B棕榈酰化水平显著增加并且其上调与NR2B-Tyr1472磷酸化同步；术后14 d在大鼠鞘内注射2-BP后，一种棕榈酰化抑制剂：NR2B棕榈酰化和磷酸化下调。因此棕榈酰化是引起神经病理性疼痛的重要组成部分，可能会成为治疗慢性疼痛的潜在靶点。

2.5 NR2B亚基泛素化 泛素化作为又一个翻译后修饰，可以改变突触蛋白的构成和功能，人们对它的认识也日渐增加。泛素是一种含有76个氨基酸的蛋白，在ATP依赖性酶反应中共价连接底物，并分为泛素激酶E1、泛素结合E2和泛素连接酶E3。泛素化要求同时作用E1、E2、E3，它紧密调控所有细胞，有精确的时间和空间性，并且E3是通过酶识别产生特异性反映的关键组成部分[33]。E3与NR2B亚基反应作为一个可能的机制，对NMDAR同时进行磷酸化和泛素化调控。有报道，Mib-2作为一种新型E3连接酶，它泛素化NMDA-NR2B受体，从而增加Tyr磷酸化依赖行为[34]。

2.6 突触前NR2B亚基 谷氨酸是主要的快速兴奋性递质在中枢系统中，主要作用于突触后受体介导兴奋神经传递[35]。现已证明释放的谷氨酸与突触后膜NMDA-NR2B亚基受体结合引起突触后膜去极化从而导致LTP[11]，却很少研究突触前NR2B对神经病理性疼痛的影响。最近有研究表明成年大鼠在外周神经损伤情况下，从脊髓初级传入中枢的释放的谷氨酸调节突触前NMDA受体，而突触前NMDA受体主要由NR2B组成；同时Western blot结果证明在大鼠脊髓损伤同侧背角神经根NR2B受体蛋白表达增多[1]。Wind-up是C-纤维初级传入神经受电刺激诱发，脊髓神经元兴奋性随其频率增加，从而增加脊髓神经元和疼痛的电活动[36]。谷氨酸激活突触前NMDA受体就是一种Wind-up现象，所以抑制突触前NR2B亚基激活可以有效的减少谷氨酸释放，从而减轻疼痛。

3 NR2B亚基的治疗前景

NMDA受体阻滞剂MK-801在很大程度上抑制脊髓背角的中枢敏化现象，但是具有严重的副作用，例如：学习和记忆障碍、感觉或运动障碍、机能亢进等[2，37]。近来有报道，在SNL大鼠中鞘内注射NR2B亚基的选择性抑制剂RO25-6981，镇痛和抗痛觉过敏作用具有剂量依赖性而不引起运动功能障碍；另一种NMDA-2B受体拮抗剂ifenprodil显著抑制机械异常性疼痛，但不是热痛觉过敏[11]。NR2B亚基的选择性抑制剂在治疗神经性病理疼痛中，对于NMDA受体拮抗剂有更强的止痛效果，并且降低了其严重的副作用，有其下原因：第一，Ro 25-6981对NR1/NR2B比NR1/NR2A受体更具选择性，是其的5 000倍[38]，而NR2B参与神经中枢机体的疼痛行为；第二，由于NR2B在脊髓浅层分布比较局限[8]，所以产生的副作用更小。

NR2B选择性拮抗剂在动物实验中有很大的进展，但是还未成为批准的药物，因为它具有hERG K+通道介导的心脏毒性并且口腔生物利用度低[39]。Tan等[40]鞘内注射针对NR2B亚基的siRNA后，减少了由外周炎症引起的疼痛反应。但是NR2B-siRNA沉默基因时间短，而shRNA构建短发卡RNA干扰真核表达载体，对脊髓NR2B有长期而稳定的基因沉默。近来，Zhang等[41]在脚底注入1%福尔马林的小鼠中鞘内注射NR2B-shRNA，引起NR2B亚基沉默并且减少了伤害性疼痛。

4 结语

综上所述，NMDA-NR2B亚基受体在疼痛传递和突触可塑性上有重要作用。但是还有很多机制尚未了解，NR2B亚基除了酪氨酸磷酸化位点与神经病理性疼痛相关外，还含有丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点；棕榈酰化、泛素化和谷氨酸调节突触前NMDA受体的具体机制尚不明确，是否能作为治疗神经病理性疼痛的新靶点?虽然，随着人们对神经性病理疼痛的深入了解，NR2B亚基拮抗剂比NMDA受体拮抗剂具有更强的止痛效果并产生更少的副作用，但是针对NR2B亚基下游蛋白，鞘内注射NR2B沉默基因或者反义寡核苷酸来治疗神经病理性疼痛，可能完全会避免产生副作用而成为新的研究靶点。

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R741.02

A

1003—6350（2015）23—3503—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.23.1268

2015-05-09)

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