伊犁河谷地区猪繁殖与呼吸综合征的流行病学调查

夏春芳，高 亮，王传锋，马玉辉

(1．伊犁职业技术学院，新疆伊宁835000;2．伊犁州昭苏县畜牧兽医局，新疆昭苏835600)

猪繁殖与呼吸综合征又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为主要特征的急性接触性传染病［1-2］。该病于1987年在美国首次被证实后迅速蔓延至许多国家和地区［3］。1996年，郭宝清等［4］首次从国内疑似PRRSV感染猪群中分离出PRRSV，我国存在该病得以证实。2006年，该病在我国中南部地区暴发后迅速传遍全国主要区域，并引起持续性感染及继发其他病原体的感染，很难得以净化，给我国养猪业带来巨大的经济损失［5-6］。

PRRSV属于动脉炎病毒科、动脉炎病毒属，为一种有囊膜的单股正链RNA病毒［7］。在结合临床症状和病理解剖的基础上，笔者应用RT-PCR检测技术对伊犁河谷地区主要规模化养猪场展开流行病学调查，了解该地区猪群中PRRS的流行态势和现状，以期为研究和制定有效的综合防控措施提供科学的参考依据。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 病料。315份组织病料分别于2014年5月至2015年7月取自伊宁市和伊宁县、察县、霍城县、新源县、尼勒克县13个规模化养猪场发病自然死亡的猪。每次采样均由随机采样，每份样品包括肺脏、脾脏、淋巴结。标记取样时间、地点及取样部位，-20℃下保存备用，病料采集情况见表1。阳性对照毒株由新疆农业大学动物医学学院传染病实验室保存并提供，为PRRSV ATCC VR-2332株。

1．1．2 酶和试剂。琼脂糖和DL2000 DNA Marker，均购自生工生物工程(上海)有限公司;M-MLV反转录酶、RNasin、dNTPs、TaqDNA聚合酶、总RNA抽提试剂 RNAiso Reagent，均购自TaKaRa公司;氯仿和无水乙醇为国产分析纯级。

1．1．3 引物。利用 Premier 5．0和 Oligo 6．0分子生物学软件，按照引物设计原则，以GenBank数据库中保守PRRSV基因序列ORF7基因序列为参照，设计了1对特异性引物，引物序列为 P1:5′-ATATGCCAAATAACAACG-3′;P2:5′-AAGAATGCCAGCCCATCATG-3′，由TaKaRa公司合成，预期扩增产物为372 bp。

1．1．4 仪器。小型高速冷冻离心机(Beckman Allegra 64)、PCR 仪(TC-5000，Bibby Scientific Ltd．)、电泳仪(DYY-Ⅲ8B，北京六一仪器厂)、凝胶成像、分析系统(英国UVP公司)等。

1．2 方法 此次调查包括发病猪群相关数据的收集和实验室检测2个部分，资料收集主要在养殖场内与病料采集同时进行;实验室检测在伊犁职业技术学院动物科学系疫病监测实验室内完成，随病料的采集陆续进行，于2015年7月底结束。

1．2．1 发病猪群相关数据的收集。与病料采集同时进行，记录发病猪群的临床症状和病死猪的病理解剖特征。此外，还要详细记录每个猪场发病猪群其他相关的资料，如猪场的规模、猪只来源及流动情况;猪群的发病既往史;猪群PRRSV免疫情况;生产母猪的流产、早产、产弱仔、死胎、木乃伊胎以及发情期等;仔猪的发病日龄、发病率、死亡率、发病持续时间等。

1．2．2 病毒总RNA的提取。量取500 mg样品放入研钵中研磨，加入适量的RNAiso Reagent至将研磨成粉末状的样品完全覆盖，室温静置至样品完全融化，继续研磨至透明状。然后，将匀浆液转移至离心管中，室温静置5 min。12 000 g 4℃下离心5 min。吸取上清液，移至新的离心管中。加入适量氯仿至匀浆裂解液中，离心管盖紧，用力振荡。充分乳化溶液至呈现乳白状后室温静置5 min，然后12 000 g4℃离心15 min，再吸取上清液转移至另一个离心管中。加入等体积的异丙醇至上清液中，而后上下颠倒使其充分混匀，15～30℃下静置10 min后12 000 g4℃再次离心10 min。此时试管底部一般会出现沉淀，小心弃去上清液，沿离心管壁缓慢地加入1 ml75%的乙醇，轻轻上下颠倒离心管，洗涤管壁。12 000 g 4℃再次离心5 min，小心弃去乙醇。室温干燥沉淀2～5 min，最后加入适量的RNase-free水溶解沉淀，至RNA沉淀完全溶解后置于-80℃条件下保存。

1．2．3 RT-PCR。反转录(RT)体系:1 μl试验样品 RNA(≤500 ng Total RNA)、2 μl MgCl2(25 mmol/L)、1 μl dNTP Mixture(各 10 mmol/L)、1 μl RT Buffer(10 × )、0．5 μl P2(50 pmol/L)、0．25 μl RNase Inhibitor(40 U/μl)、0．5 μl AMV Reverse Transcriptase(5 U/μl)、3．75 μl RNase Freed H2O。扩增条件如下:50℃反转录反应20 min;99℃变性5 min;5℃冷却5 min，1个循环。

PCR反应体系为:反应体系为50μl，包括10μl模板cDNA、10 μl PCRBuffer(5 ×)、28．75 μl dH2O、0．25 μl Ex Taq酶(5 U/μl)、0．5 μl P1(25 pmol/L)、0．5 μl P2(25 pmol/L)。反应循环参数为:94℃变性2 min;94℃变性1 min;55℃退火30 s;72℃延伸1 min，共进行30个循环;最后72℃再延伸10 min。结束后将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2 结果与分析

2．1 RT-PCR扩增结果 从图1可以看出，从病猪肺脏、脾脏、淋巴结病料及阳性对照株中均扩增出长度为372 bp的特异性目的条带，谱带清晰，与预期结果相一致，而阴性对照未扩增到此特异性条带。这说明被检猪病料中含有PRRSV的特异性靶序列，已被PRRSV所感染。

2．2 不同地区样品的PRRSV阳性率 此次调查采样共315份，PRRSV检测结果为阳性的样品207份，阳性率达65．7%，阳性样品猪的临床症状及病理解剖基本符合PRRSV感染特征。207份阳性样品分别来自伊宁市、察县、伊宁县、霍城县、尼勒克县、新源县的13个养殖场。其中，人口及养殖场较为密集的伊宁市、察县和伊宁县的阳性率分别为85．3%、75．9%和69．4%，显著高于新源县和尼勒克县。各县(市)阳性样品数及阳性率见表1。

表1 伊犁河谷地区PRRS病料的阳性率

2．3 不同月龄样品的PRRSV阳性率 由表2可知，不同月龄猪群均有PRRSV阳性样品。1月龄、2月龄、3月龄及大于3 月龄的小组阳性率分别为 60．0%、79．3%、60．5% 和39．1%，总阳性率分别为 17．1%、29．2%、16．5% 和 2．86%。其中，2月龄仔猪的阳性率最高，大于3月龄猪的阳性率最低，与其他组差异显著;小于1月龄及3月龄猪的阳性率相近，差异不显著。

表2 不同月龄样品的PRRSV阳性率

2．4 不同季节样品的PRRSV阳性率 由表3可知，不同季节采集的病猪样品各小组阳性率分别为68．1%、64．1%、63．8%和68．3%，其中春季和冬季的阳性率略高于夏季和秋季，但差异不显著。

表3 不同季节样品的PRRSV阳性率

3 讨论

3．1 将RT-PCR检测技术用于PRRSV诊断的优越性 鉴于临床中PRRS病例大多为混合感染或继发感染，PRRS诊断难度增大，必须将临床症状、病理变化、血清学诊断及分子学诊断等结合起来。临床症状和病理变化只能进行初步诊断，若要进一步确诊必须依靠实验室诊断技术。此次调查结果表明，通过临床检查及病理变化的疑似病例的病料中大多能扩增出大小372 bp的特异性条带，证实RT-PCR检测技术具有快速、简便、特异性强等优点，是检测PRRSV的好方法。

3．2 伊犁河谷地区猪繁殖与呼吸综合征的流行情况 伊犁河谷地区规模化养猪场普遍存在PRRSV感染情况，已对该地区养猪业构成严重威胁，与国内其他省份的调查报道结果相似，应引起高度重视。伊宁市、察县、伊宁县PRRSV的阳性率分别为85．3%、75．9%和69．4%，显著高于新源县和尼勒克县。究其原因，主要包括以下方面:①伊宁市、察县、伊宁县养猪场相对较为密集，尤其是小型养殖户较多，这些小型养殖户养殖规模小、密度大、猪舍简陋、卫生差、污染严重、防疫观念淡薄;②人员来往、猪只流通较为频繁和盲目引种，而相当一部分小型养殖场难以建立完善的防疫隔离屏障，给该病的传播创造了有利条件。

此次调查中不同月龄的猪只感染发病率存在明显差异。采样的315头病死猪中，1～2月龄仔猪阳性率较高，而大于3月龄猪阳性率相对较低，这表明1～2月龄的仔猪的发病率最高，也是PRRSV主要的贮存宿主。该试验中不同季节猪群感染PRRSV并发病差异不明显，这与路宪礼等［8］和李和平等［9］报道结果不一致。这可能与猪群隐性带毒、发病猪群的持续性感染、PRRSV的变异和混合感染等因素有关，还有待进一步研究。

［1］CHO J G，DEE SA．Porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］．Theriogenology，2006，66(3):655-622．

［2］杨汉春．猪繁殖与呼吸综合征综述［J］．猪业科学，2006(5):19-20．

［3］KEFFABER K．Reproductive failure of unknown etiology［J］．Am Assoc Swine Pract Newsl，1989，2:1-10．

［4］郭宝清，陈章水，刘文兴，等．从疑似PRRS流产胎儿分离PRRSV的研究［J］．中国畜禽传染病，1996(2):1-4．

［5］童光志，周艳君，郝晓芳，等．高致病性猪繁殖与呼吸综合症病毒的分离鉴定及分子流行病学分析［J］．中国预防兽医学报，2007，29(5):323-326．

［6］谈志祥，刘道新，何世成，等．湖南省高致病性猪蓝耳病流行情况调查与分析［J］．养猪，2007(6):39-40．

［7］陈溥言．家畜传染病学［M］．5版．北京:中国农业出版社，2006:221-223．

［8］路宪礼，周碧君，罗险峰，等．贵州省猪繁殖与呼吸综合征流行病学调查［J］．贵州农业科学，2010，38(5):133-136．

［9］李和平，吴发兴，李晓成，等．河南省猪繁殖与呼吸综合征流行病学调查［J］．畜牧兽医科学，2007，23(4):19-21．