生物大分子电化学传感器的研究进展

路 勇， 朱思维， 宋晶晶， 黄勤安， 尉 艳

(皖南医学院 基础医学院，安徽 芜湖 241000)



生物大分子电化学传感器的研究进展

路 勇， 朱思维， 宋晶晶， 黄勤安， 尉 艳

(皖南医学院 基础医学院，安徽 芜湖 241000)

生物大分子电化学传感器是围绕生物大分子的检测分析研究而开发出来的一系列电化学传感器，在这些传感器中尤其是以纳米间隙电化学传感器性能最为优异，在实际的检测研究中表现出超高灵敏度、微型化、较好的选择性、所需检测样品少、检测速度快、非常便捷等明显优势，因而受到了研究人员的极大关注.本文简单介绍了生物大分子电化学传感器的原理、分类、加工技术及特点，着重分析了间隙电化学传感器较比常规电化学传感器所具备的优越特点.综述了近十年来生物大分子的检测研究进展，特别是纳米间隙电化学传感器在生物大分子检测研究中的应用，并对生物大分子电化学传感器的研究和开发进行展望.

生物大分子;电化学传感器;生命分析;纳米间隙电极;生物芯片

生物大分子是生物体内具有生物活性和复杂空间结构的各种分子量在一万或数万左右的生物有机分子，包括蛋白质、核酸、多糖等.生物大分子具有特定的生化结构(组成、序列和构象)、分子量大、结构复杂等特点，这些特点也决定了他们具有特定的生物活性以及在生物体中发挥着重要的生命功能，如维持生物的新陈代谢、遗传信息的传递、生长发育的调节、提供重要的免疫功能，同时也是一些疾病和生命特征的信号标志.由于生物大分子所体现出来的重要生命功能，因此人们对生物大分子的研究也一直在延续和发展，其中一项研究就是生物大分子的检测，特别是在临床免疫、血液细胞，和分子生物学方面的检测研究.通常的检测方法有电分析化学检测方法、分子生物学检测方法(如实时荧光定量RT-PCR、流式细胞术等)、免疫学检测方法(如酶联免疫吸附剂测定法-ELISA等)、光谱法、荧光共振能量转移技术等，其中电分析化学检测方法由于近年来新型电分析化学技术的出现以及各种性能优越的生物大分子电化学传感器的研发和应用，使得它成为生物分子检测研究的热点.

在生物大分子电化学传感器的研发过程中，各种纳米材料的注入和纳米加工技术的发展为生物传感器的发展提供了新的动力，很大程度上推动了生物大分子电化学传感器技术的飞速发展，也使得它在灵敏度的提高和集成化、微型化发展方面取得了长足的进步[1-2].其中通过纳米材料加工技术制备出来的多种纳米间隙电化学传感器则表现出更为优越的性能，呈现出检测限更低、灵敏度更高、体积更小、易于开发成生物芯片等优异性能，为生物大分子的痕量检测提供了一条新的思路.

本文对生物大分子电化学传感器及其在生物大分子检测方面的具体应用研究进行了综述.

1 生物大分子电化学传感器

生物大分子电化学传感器是以生物分子作为敏感元件，以各类电极作为信号转换元件，来测量电极在电解质溶液中电化学特征检测信号(电流、阻抗等)变化的传感器.根据电化学传感器的结构类型可分为常规电化学传感器和间隙电化学传感器，其中间隙电化学传感器又可分为微米间隙电化学传感器和纳米间隙电化学传感器.

1.1 常规电化学传感器

常规电化学传感器就是已经被广泛使用的、具有常规形态的电化学传感器，如玻碳电极传感器、金电极传感器、银电极传感器等.常规电化学传感器具有工作面积大、导电性能强、化学及电化学稳定性较高、经抛光清洗后可反复使用、可适用于较宽的电势窗等优点.因此，裸常规电化学传感器和经过改造之后的常规电化学传感器在传感器研究领域被非常广泛的使用.

图1 IgG生物亲和性电化学传感器的装配过程示意图

裸常规电化学传感器通常会经一些高分子聚合物膜(如聚-甲苯胺蓝O、聚2,6-吡啶二胺)、具有特殊结构的大分子化合物(如环糊精、冠醚、朴啉)和具有优越性能的纳米材料(如碳纳米管、纳米金、纳米银、纳米金属氧化物)等修饰，来提高它的检测灵敏度、改善它的选择性和扩大它的适用性.例如，Ya-li Yuan等研究人员以金电极传感器为基础电极，结合氨基功能化纳米二氧化钛(Nano-TiO2)的覆盖，通过戊二醛将IgG抗体与电极连接，利用生物素-链霉亲和素的结合以及双酶底物循环制备出一种用于IgG检测分析的生物亲和性电化学传感器(如图 1所示)[3].

Jin-fen Wang等针对人绒毛膜促性腺激素(HCG)的免疫检测，成功研制出一种新颖的基于金纳米颗粒和聚2,6-吡啶二胺(PPA)/多壁碳纳米管复合物的电化学生物传感器[4].由于PPA和多壁碳纳米管的协同效应，以及GNP的独特性质，该传感器显示出相对较低的检测限0.3mIUmL-1，以及良好的稳定性和可重复性.

然而常规电化学传感器所具有的体积较大、工作面积大的特点，也成为了它在电极微型化发展过程中的一个缺点，虽然经一些性能优越的活性材料修饰改造后，一定程度上提高了它的检测性能，但在传感器芯片的研制方面，特别是在生物传感器芯片的研制方面，并不能发挥它的作用.

1.2 间隙电化学传感器

间隙电化学传感器不同于常规的电化学传感器，它是由一个或者多个电极对/电极阵列构成，电极对/电极阵列之间具有一定尺寸的电极间隙，电极间隙尺寸一般较小(常为微米级和纳米级).根据间隙尺寸的大小，通常将间隙电化学传感器分为微米间隙电化学传感器和纳米间隙电化学传感器.

1.2.1 间隙电化学传感器的加工 微米间隙电化学传感器是电极间隙尺寸大小为微米级的间隙电化学传感器，在各种微米间隙电化学传感器中，较为常见的是微阵列电极中的微型叉指阵列电极(Interdigitated array microelectrodes)[5].此类电极常用的加工技术为光刻技术，它是制作微纳米结构材料的核心加工技术，并且是一种可以进行大规模生产的微结构加工技术.但是此种技术由于掩膜版的制作间隙尺寸很难达到纳米级，最小只能做到亚微米量级，因此无法用于纳米间隙电极的普遍加工.

纳米间隙电化学传感器是指电极间隙尺寸大小达到纳米级(100nm以内)的间隙电化学传感器.由于普通的加工技术无法做到纳米级别，因此纳米间隙电极的制作对电极加工技术有较高的要求，但随着近些年材料加工技术的发展，为纳米间隙电化学传感器的制作提供了一些有效的构建手段.如电子束刻蚀法、原子力显微镜纳米刻蚀法、接点断裂法、电子迁移法、碳纳米管掩模法、选择性化学沉积与光刻工艺相结合的方法、及纳米材料在电极间隙中自组装的方法等.

1.2.2 间隙电化学传感器的特点 与常规电化学传感器相比，间隙电化学传感器用于生物大分子的检测研究具有以下优势：(1)电极对/电极阵列的尺寸及其间隙尺寸通常为微米级或纳米级，使其检测灵敏度明显提高，并且尺寸较小的纳米间隙电化学传感器，则具有更高的检测灵敏度和更加优越的检测性能；(2)间隙电化学传感器的工作面积较小，这既易于实现传感器的微型化，也可以减少检测样品的使用量；(3)间隙电化学传感器有利于构建无标记型电化学传感器，可以免去酶、荧光、放射性物质等的标记，从而简化检测步骤，缩短检测耗时，降低检测成本.

1.3 生物大分子电化学传感器的应用

近年来，针对不同生物大分子的电化学检测一直都是生命分析领域的研究热点，通常生物大分子可分为核酸、蛋白质、糖、脂以及它们的复合物，如DNA、酶、激素、生长因子、免疫球蛋白、肿瘤标志物及一些其它的糖蛋白、脂蛋白等.将电化学传感器用于生物大分子的检测表现出灵敏度高、选择性好、检测速度快、便捷等优点.

1.3.1 常规电化学传感器对生物大分子的检测研究 常规电化学传感器对生物大分子的检测研究相对较多，通常是以玻碳电极、金电极等其它一些常规电极为基电极，将具有优越性能的纳米材料、高分子膜聚合物及一些生物放大信号酶结合到电极表面构筑而成.

图2 肿瘤标志物前列腺癌蛋白抗原电化学传感器的制备过程

Lu-dan Wu等用三维石墨烯缀合金纳米颗粒(3D-GR@AuNPs)来修饰玻碳电极(GCE)，从而提供了一种有效基质用于抗体的固定，再利用纳米多孔银@碳量子点作为信号放大标签，制作而成的一种超灵敏电化学发光免疫传感器用于肿瘤标志物前列腺癌蛋白抗原(PSA)的检测(如图2)[6].

Hong-chuan Yang等以玻碳电极作为基电极，将辣根过氧化物酶(HRP)-功能化的普鲁士蓝-碳纳米管/金纳米粒子复合材料作为信号放大的标签所构建的电化学传感器，用于人绒毛膜促性腺激素(HCG)的灵敏检测[7].该方法所制备的电化学生物传感器具有较高的灵敏度(检测限可低至0.023mIU/mL)、较好的稳定性和可重复性，并且可以扩展应用到其他靶蛋白的检测中.Ru Li等基于纳米多孔金和石墨烯制备出无免疫标记的安培传感器，用于人绒毛膜促性腺激素的检测.结果表明，此种传感器具有较高的准确性，并且固定基质纳米多孔金也表现出较好的增敏作用与稳定性[8].Gen-xi Li研究小组提出了一种新的电化学适体传感器用于血清中凝血酶的高灵敏、宽浓度范围和高特异性痕量检测[9].

图3 微米间隙电化学传感器用于人白细胞介素5检测的示意图

1.3.2 间隙电化学传感器对生物大分子的检测研究 间隙电化学传感器较比常规电化学传感器出现的要晚，由于其所具有的独特性能，在生物大分子的检测方面表现出灵敏度更高、操作步骤简单、试剂消耗少、可接受的稳定性和选择性等优点.

1.3.2.1 微米间隙电化学传感器对生物大分子的检测研究 常见的微米间隙电化学传感器是从八十年代初开始被研究者们所认识的各种微阵列电极不断发展而来.它既保留了微电极的优点，又在一定程度上改善了其检测性能，使其在电化学传感方面的发展较为迅速.

Junhyoung Ahn等将金纳米粒子的信号放大作用和亚微米间隙叉指电极相结合，研发出一种比酶联免疫测定法(ELISA)灵敏度更高的人白细胞介素5(IL5)的检测方法，如图3所示[10].其测定过程包括三个主要步骤：白细胞介素5形成抗原-抗体复合物，通过夹心式免疫测定法将金纳米粒子缀合在IL5上，金对电信号的增强作用.经条件优化后，人白细胞介素5的检测限可以低至1pg/mL.

Ryuzo Ohno等基于微米间隙电极成功构建了一种无免疫标记的电化学阻抗人免疫球蛋白A (IgA)电化学传感器[11].通过人免疫球蛋白A抗体(anti-IgA)在电极表面固定，使人免疫球蛋白A结合被到电极表面，从而达到检测的目的.通过这种很简单的方法，就可以实现IgA的灵敏检测(0.01-100ng/mL)，说明微米间隙电化学传感器具有检测灵敏度高、操作简单的优越性能.

1.3.2.2 纳米间隙电化学传感器对生物大分子的检测研究 针对尺寸较小的生物分子的检测，该设备最好具有非常小的尺寸特征，紧凑，并提供足够水平的灵敏度，如今纳米间隙电化学传感器作为痕量生物分子检测的强有力手段正在逐渐扩大研究.

图4 (A)所述的纳米-金属/绝缘体/金属多层传感器装置示意图.一个5-20纳米厚的绝缘层被夹在一对金微电极之间，所述纳米间隙的宽度可以很容易地通过改变绝缘层的厚度来调节. (B)检测程序：(I)两个不同的捕获探针横跨纳米间隙的固定;(II)与靶DNA杂交(绿色);(Ⅲ)沿着桥连分子骨架形成一个可以在电极对间构成导电通路的银导线.

如Zhi-qiang Gao等通过使用标准的硅微加工技术(考虑到大规模生产的成本效益和可行性)，根据电子传导机制，研制出一种新的用于DNA量化的纳米间隙传感阵列电极(如图 4所示)[12].其机制是基于通过目标DNA的两个末端与电极对上两个不同的表面结合捕获探针之间的杂交，从而桥接纳米间隙，再通过进一步简单的金属化过程，就可以导通纳米间隙.在一个表面很干净(<1.0PS)的传感器上，仅有1.0fM靶DNA的存在下就可以获得大约2个数量级的电导增强.就电导和DNA浓度之间的线性关系可看到，从1.0fM到1.0pM一个异常信号强度(每单位浓度2.1×104%)的变化.变化如此之大的电导率，使得它能够明确地检测定量DNA浓度，并且可以避免当前DNA试验中所需要使用的靶DNA扩增.此外，由于该传感器阵列独特的垂直排列纳米结构和双探针配置，使得它还具有优异的单碱基错配鉴别能力.

图5 测量纳米间隙电容的实验装置.(a)所述纳米间隙电极两线阻抗测量设置；(b)一纳米间隙的SEM图;(c)充满电解质的纳米间隙.

Luke P. Lee等提出了纳米间隙电容作为潜在的无标记生物传感器的理论和实验研究(如图 5所示)[13].研究者们通过使用20纳米间隙的多晶硅间隙电极，在仅需1.2pL溶液中，成功测定了100nM的拥有20对(20-mer)碱基的单链DNA(ssDNA).由于纳米间隙的大小(5-100nm)减小了电极极化效应(无论频率大小)，因此纳米间隙电极具有成为生物分子纽带的潜力.当间隙尺寸比双电层厚度小时，纳隙电容对离子强度的依赖性不大.这是把电容变化作为目标分子存在指示器的关键.

在此，特别提出一种综合纳米材料和微型叉指阵列电极研制出来的一种纳米间隙电化学生物传感器，在生物大分子的检测研究中表现出制备简单、间隙可控、较高的检测灵敏度和选择性等优势，正在逐渐被人们开发和改进，从而更好的应用于目标分子的痕量检测.

如Jinming Kong等开发了一种纳米间隙生物传感器，用于核酸的超灵敏电检测，如图6所示[14].在这项研究中，肽核酸探针被固定在叉指微电极对的间隙中，然后用它们与互补靶DNA杂交.在此之后，果胶分子通过磷酸锆和锆-碳酸酯化学反应引入DNA链，并且在高碘乙酸盐缓冲液(acetate buffer，pH3.98)中进行氧化.新产生的醛基作为反应物，以分解氨银离子，从而产生银纳米粒子(SNPs)用于桥连微型叉指阵列电极的间隙.金属纳米粒子的导电性将直接与杂交的DNA的量相关.在最佳条件下，此传感器表现出非常高的3fM检测灵敏度(S/N>3)，并且本生物传感器也可适用于RNA的直接检测.此外，Cheng Fang小组研制出一种以生物传感器芯片为基础，通过金纳米粒子聚集体(AGNPs，)作为导电标签的生物传感器，实现了从50fM-10pM低浓度条件下，22-对(22-mer)寡核苷酸DNA的直接电检测[15].

图6 果胶(Pectin)模板化银纳米线形成的示意图

2 结语与展望

生物大分子电化学传感器作为电化学生物传感器中一种专门针对生物大分子快速、灵敏检测和分析的研究技术，为生命科学的研究提供了一种新的手段，在疾病的临床诊断、疾病治疗过程中的实时监测、体内药物活性的分析、基因组学、蛋白质组学等生命分析领域得到了广泛的应用.特别是小尺寸的纳米间隙电极可以进行电极的微型化、集成化和高通量研究，为生物芯片的开发提供一种新的方向和支持.但目前有关此类传感器的加工技术以及在生命分析方面的研究依然处于基础阶段且缺乏研究，电极的稳定性以及对复杂检测环境的适用性不足，并且已有的研究多是使用电学的检测手段，而在使用电化学发法对目标分子进行检测方面的研究则基本没有，因此围绕该传感器更为优良的加工技术的研发、检测稳定性和适用性方面的研究将依然会是一个相当热门的研究领域并且这也是开发微型化、集成化、高通量和低成本生物芯片的研究重点.

[1] 金利通，鲜跃仲，张芬芬.纳米电化学与生物传感器的研究进展[J].华东师范大学学报：自然科学版，2005，5(6)：13-24.

[2] 杨海朋，陈仕国，李春辉，等.纳米电化学生物传感器[J].化学进展，2009，21(1)：210-216.

[3] YUAN Y L, YUANG R, CHAI Y Q, et al. An electrochemical enzyme bioaffinity electrode based on biotin-streptavidin conjunction and bienzyme substrate recycling for amplification[J]. Analytical Biochemistry, 2010,45:121-126.

[4] WANG J F, YUAN R, CHAI Y Q. A novel immunosensor based on gold nanoparticles and poly-(2,6-pyridinediamine)/multiwall carbon nanotubes composite for immunoassay of human chorionic gonadotrophin[J]. Biochemical Engineering Journal, 2010,51:95-101.

[5] VARSHNEY M, LI Y B. Interdigitated array microelectrodes based impedance biosensors for detection of bacterial cells[J]. Biosensors and Bioelectronics,2009,24(10):2951-2960.

[6] WU L D, LI M, ZHANG M, et al. Ultrasensitive electrochemiluminescence immunosensor for tumor marker detection based on nanoporous sliver@carbon dots as labels[J]. Sensors and Actuators B, 2013,186:761-767.

[7] YANG H C, YUAN R, CHAI Y Q, et al. Electrochemical immunosensor for human chorionic gonadotropin based on horseradish peroxidase-functionalized Prussian blue-carbon nanotubes/gold nanocomposites as labels for signal amplification[J]. Electrochimica Acta, 2011,56:1973-1980.

[8] LI R, WU D, LI H, et al. Label-free amperometric immunosensor for the detection of human serum chorionic gonadotropin based on nanoporous gold and graphene[J]. Analytical Biochemistry, 2011,414:196-201.

[9] ZHAO J, HU S S, ZHONG W D, et al. Highly sensitive electrochemical aptasensor based on a ligase-assisted exonuclease III-catalyzed degradation reaction[J]. Appl.Mater.Interfaces, 2014,6:7070-7075.

[10] AHN J, LEE T H, LI T H, et al. Electrical immunosensor based on a submicron-gap interdigitated electrode and gold enhancement[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2011,26:4690-4696.

[11] OHNO R, OHNUKI H S, WANG H H, et al. Electrochemical impedance spectroscopy biosensor with interdigitated electrode for detection of human immunoglobulin A[J]. Biosensors and Bioelectronics 2013,40:422-426.

[12] ROY S, CHEN X J, LI M H, et al. Mass-produced nanogap sensor arrays for ultrasensitive detection of DNA[J]. Am Chem Soc, 2009,131:12211-12217.

[13] YI M Q, JEONG K H, LEE L P. Theoretical and experimental study towards a nanogap dielectric biosensor[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2005,20:1320-1326.

[14] KONG Jinming, FERHAN A R, CHEN Xiantong, et al. Polysaccharide templated silver nanowire for ultrasensitive electrical detection of nucleic acids[J]. Analytical Chemistry, 2008,80:7213-7217.

[15] FANG C, FAN Y, KONG J M, et al. Electrical detection of oligonucleotide using an aggregate of gold nanoparticles as a conductive tag[J]. Analytical Chemistry, 2008,80:9387-9394.

Advances in Biological Macromolecules Electrochemical Sensor

LU Yong, ZHU Si-wei, SONG Jing-jing, HUANG Qin-an, WEI Yan

(Basic Medicine College, Wannan Medical College， Wuhu 241000, China)

Biological macromolecules electrochemical sensors are a series of electrochemical sensors which are developed to detect the biological macromolecules. The nano-gapped electrochemical sensor is most outstanding of them. Due to the high sensitivity, miniaturization, better selectivity, small test sample, test speed, very convenient and other obvious advantages, it has caused the extensive concern and researth. This review briefly introduced the principle, classification, processing techniques and features of biological macromolecules electrochemical sensors and mainly analyzed the superior features of the gap electrochemical sensors in comparison with the conventional electrochemical sensor. The detection of biological macromolecules in recent ten years was summarized and the applications of the nano-gap electrochemical sensors at the biological macromolecules detection were focused. The development of the biological macromolecules electrochemical sensors was also discussed.

biological macromolecule; electrochemical sensor; life analysis; nano-gapped electrodes; biochip

10.14182/J.cnki.1001-2443.2015.03.009

2015-03-25

2014高校优秀青年人才支持计划.

路勇(1989-)，男，汉，安徽宿州人，硕士研究生，研究方向为生物分析化学.通讯作者：尉艳(1977-)，女，教授，安徽芜湖人，研究方向为生物传感.

路勇，朱思维，宋晶晶，等.生物大分子电化学传感器的研究进展[J].安徽师范大学学报：自然科学版，2015，38(3)：254-259.

12.3 O657.1

A

1001-2443(2015)03-0254-06