ILK介导TGF－β/Smad通路诱导肾小球内皮细胞－间充质细胞转分化的研究＊

林 琳，郑 晶，朱伟平

（中山大学附属第五医院肾内科，广东珠海519000）

肾脏纤维化是各种肾脏疾病进展到终末期肾衰竭的共同病理特征，以大量基质蛋白积聚和成纤维细胞增殖为主要的病理表现［1］。已有大量研究显示，肾小管上皮细胞－间充质细胞转分化（EMT）在肾脏纤维化的发生发展中起着重要的作用［2］。TGF－β1通过TGF－β/Smad信号途径上调整合素连接激酶（ILK），通过ILK调节细胞黏附、生存、分化和凋亡，从而引起细胞外基质（ECM）的积聚是促进肾脏纤维化的机制。已有研究报道，血管内皮细胞－间充质细胞转分化（EndMT）在心脏和肿瘤相关的器官纤维化中起重要作用［3］，并且可能在肾脏纤维化发病机制中有重要作用。ILK作为TGF－β/Smad通路的下游效应因子可能参与介导EndMT，但是对于ILK介导TGF－β/Smad信号通路诱导EndMT在肾脏纤维化中的作用却鲜有报道。本文研究ILK在EndMT及其信号传导通路中的作用，将进一步阐明肾脏纤维化的发生机制，并为肾脏纤维化的治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 原代人肾小球内皮细胞（HGEnC），购自美国Scien Cell公司。

1.2 仪器与试剂 胎牛血清、内皮细胞生长添加剂、内皮细胞培养基（美国Scien Cell公司），TGF－β1（美国Peprotech公司）；TGF－β1Ⅰ型 受 体 抑 制 剂 LY364749、ILK 抑 制 剂 QLT－0267（德国Merk公司），蛋白酶抑制剂（美国Roche公司），小鼠抗人E－cadherin、小鼠抗人α－SMA单克隆抗体、小鼠抗人成纤维细胞特异蛋白－1（FSP－1）单克隆抗体及小鼠抗人内皮细胞黏附分子1（CD31）单克隆抗体（美国Sigma公司），兔抗人磷酸化Smad 2/3（p－Smad2/3）多克隆抗体、兔抗人ILK 单克隆抗体（美国Santa Cruz公司），异硫氰酸荧光素（FITC）标记羊抗鼠IgG（丹麦DAKO公司），总RNA提取试剂盒、Trizol试剂盒、反转录试剂盒（美国Invitrogen公司），P－Smad2/3、ILK 及内参GAPDH引物（上海鼎安生科科技有限公司）。引物及产物长度见表1。CO2恒温培养箱（美国SHELAB公司），EXL808全自动酶标仪（美国 BIO－TEK公司），SYBR Green PCR Reagents、ABI 7500Real Time PCR System（美 国 ABI公司）。

表1 引物序列及产物长度

1.3 方法

1.3.1 细胞培养与分组 原代细胞按常规方法复苏后，加入含有5%胎牛血清、内皮细胞生长添加剂、内皮细胞培养基培养，置37℃5%CO2培养箱内传代培养，选取第2～4代细胞，当细胞张至70%～80%融合，用无血清培养基静止24h进行同步化后进行试验。将同步化后的细胞按照105个/mL浓度接种入6孔板中，每孔2mL。将HGEnC分为6组。A组（空白对照）、B组（TGF－β112.5ng/mL）、C组（TGF－β125.0ng/mL）、D 组（TGF－β1 50.0ng/mL）、E 组（TGF－β1 50.0ng/mL＋LY364749 5.0μmol/mL）、F 组（TGF－β1 50.0 ng/mL＋QLT－0267 5.0μmol/mL），每组设12个复孔。

图1 细胞形态学的结果

1.3.2 细胞形态学观察 各组细胞分别培养48、72h采用倒置相关显微镜下观察细胞形态变化。

1.3.3 RT－PCR 以 RT－PCR 测定 P－Smad2/3、ILK mRNA表达水平。按照说明书提取试剂盒制备总RNA。取RNA样品，用核酸分析仪进行定量，测定260和280nm的吸光度（A）值，控制A260/A280在1.9～2.1。然后应用ABI 7500Real Time PCR System进行扩增。使用基于内参物GAPDH的相对定量分析，以2－△△Ct计算目的基因mRNA表达量。

1.3.4 Western－blot 以 Western－blot测定 P－Smad2/3、ILK及E－cadherin、CD31、α－SMA 和 FSP－1蛋白的表达。用 Trizol提取细胞总蛋白后BCA法测定蛋白浓度。采用凝胶电泳分离不同相对分子质量蛋白质，然后将蛋白转移至PVDF膜，脱脂奶粉室温封闭1h，一抗4℃孵育过夜。漂洗3次后加入二抗室温孵育2h。ECL化学发光、显影和定影。用美国UVP公司LabWorks 4.5软件对条带进行定量分析，以GAPDH为内参，用目的蛋白吸光值与内参吸光度值的比值代表目的蛋白的相对表达含量。

1.4 统计学处理 采用SPSS15.0软件进行统计学分析，计量资料用±s表示，多样本均数间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 TGF－β1在EndMT过程中的作用

2.1.1 细胞形态学的结果 A组细胞多呈圆形和卵圆形。B组培养48h后已有部分转化为成纤维细胞，B组培养72h后更多内皮细胞转化为成纤维细胞，见图1。

2.1.2 PCR结果 HGEnC与不同浓度 TGF－β1共同培养后P－Smad2/3和ILK mRNA水平显著升高（P＜0.01），并且具有剂量依赖性（P＜0.01），见表2，图2。

2.1.3 Western blots结果 HGEnC与不同浓度 TGF－β1共同培养后P－Smad2/3、ILK、α－SMA和 FSP－1蛋白水平显著升高（P＜0.01），而 E－cadherin和 CD31水平显著降低（P＜0.01），并且具有剂量依赖性（P＜0.01），见表3、图3。

表2 各组细胞P－Smad2/3和ILK mRNA水平的比较（±s，n＝6）

表2 各组细胞P－Smad2/3和ILK mRNA水平的比较（±s，n＝6）

a：P＜0.01，与A组比较；b：P＜0.01，与B组比较；c：P＜0.01，与C组比较。

0.47±0.05 0.05±0.03 B组 0.63±0.06a 0.15±0.05a C组 0.84±0.08ab 0.26±0.04ab D组 1.30±0.09abc 0.48±0.06 ILK A组组别 P－Smad2/3 abc

图2 PCR结果

2.2 ILK在 TGF－β1介导EndMT中的作用

2.2.1 PCR结果 TGF－β1Ⅰ型受体抑制剂LY364749均可显著抑制 TGF－β1导致的P－Smad2/3和ILK mRNA水平的升高（P＜0.01）；ILK 抑制剂 QLT－0267均可显著抑制 TGF－β1导致的ILK mRNA水平的升高（P＜0.01），但是对P－Smad2/3 mRNA无显著影响（P＞0.05），见表4、图4。

表3 各组细胞P－Smad2/3、ILK及E－cadherin、CD31、α－SMA和FSP－1蛋白水平的比较（±s，n＝6）

表3 各组细胞P－Smad2/3、ILK及E－cadherin、CD31、α－SMA和FSP－1蛋白水平的比较（±s，n＝6）

a：P＜0.01，与A组比较；b：P＜0.01，与B组比较；c：P＜0.01，与C组比较。

4±0.03 0.26±0.05 B组 1.23±0.10a 0.24±0.05a 0.52±0.05a 0.65±0.09a 0.32±0.05a 0.57±0.06a C组 1.57±0.16ab 0.46±0.08ab 0.42±0.03ab 0.54±0.07ab 0.39±0.04ab 0.86±0.09ab D组 2.54±0.21abc 0.86±0.11abc 0.32±0.05abc 0.43±0.06abc 0.73±0.06abc 1.76±0.12－SMA FSP－1 A组 0.98±0.08 0.12±0.03 0.68±0.04 0.84±0.09 0.2组别 P－Smad2/3 ILK E－cadherin CD31 α abc

图3 Western blots结果

2.2.2 West blots结果 TGF－β1Ⅰ型受体抑制剂 LY364749均 可 显 著 抑 制 TGF－β1 导 致 的 P－Smad2/3、ILK、α－SMA 和FSP－1蛋白水平的升高（P＜0.01），并且显著抑制 E－cadherin和CD31蛋白水平的降低（P＜0.01）；ILK抑制剂 QLT－0267可显著抑制TGF－β1导致的ILK、α－SMA和FSP－1蛋白水平的升高（P＜0.01），并且显著抑制E－cadherin和CD31蛋白水平的降低（P＜0.01），但是对P－Smad2/3蛋白的抑制作用差异无统计学意义（P＞0.05），见表5、图5。

表4 3组细胞P－Smad2/3和ILK mRNA水平的比较（±s，n＝6）

表4 3组细胞P－Smad2/3和ILK mRNA水平的比较（±s，n＝6）

a：P＜0.01，与D组比较。

1.32±0.16 0.52±0.07 E组 0.84±0.09a 0.27±0.05a F组 1.29±0.07 0.31±0.06 ILK D组组别 P－Smad2/3 a

图4 PCR结果

表5 3组细胞P－Smad2/3、ILK及E－cadherin、CD31、α－SMA和FSP－1蛋白水平的比较（±s，n＝6）

表5 3组细胞P－Smad2/3、ILK及E－cadherin、CD31、α－SMA和FSP－1蛋白水平的比较（±s，n＝6）

a：P＜0.01，与D组比较。

5±0.07 1.73±0.15 E 组 1.72±0.19a 0.48±0.09a 0.51±0.05a 0.61±0.06a 0.40±0.06a 0.94±0.11a F组 2.52±0.22 0.53±0.08a 0.44±0.04a 0.54±0.04a 0.44±0.06a 0.90±0.12－SMA FSP－1 D组 2.56±0.23 0.95±0.13 0.30±0.06 0.40±0.05 0.7组别 P－Smad2/3 ILK E－cadherin CD31 α a

图5 Western blots结果

3 讨 论

肾脏纤维化是多种肾脏疾病走向肾衰竭的共同途径，是多种慢性肾病的共同病理基础。既往认为肾脏组织中肌成纤维细胞主要来源于局部固有成纤维细胞、骨髓源性细胞、肾小球系膜细胞和EMT。2007年Zeiberg等［4］首次发现血管End－MT在心脏和肿瘤相关的器官纤维化中起重要作用。EndMT参与成纤维细胞和肌成纤维细胞的堆积，提示EndMT可能是肾早期纤维化的主要原因［5］。EndMT可以被许多细胞和细胞因子所诱导，TGF－β被认为是最重要的因子，在各种进行性肾脏疾病发展为肾脏纤维化过程中发挥了重要作用，是引起肾小球硬化及肾间质纤维化的主要介质。ILK是一种丝氨酸－苏氨酸蛋白激酶，近年来研究发现ILK与肾脏间质纤维化具有密切的关系［6］。目前认为ILK通过整合素信号转导途径和TGF－β/Smad信号转导途径促进肾间质纤维化的发生发展。但是对于ILK介导TGF－β/Smad信号通路诱导EndMT的作用却鲜有报道，因此本文对该过程中ILK介导TGF－β/Smad信号通路诱导的作用进行研究。

在本研究中，TGF－β1与HGEnC共同培养后部分内皮细胞已转化为成纤维细胞，因此初步提示 TGF－β1促进了HGEnC的EndMT过程。近年来发现TGF－β1信号转导级联从细胞膜传入细胞核与基因表达偶联依赖于Smad家族蛋白的调节，而P－Smad2/3是 TGF－β1/Smad信号通路中的重要信号转导分子，其mRNA和蛋白表达量则是TGF－β1/Smad信号通路激活程度的标志［7］。TGF－β1与HGEnC共同培养后 PSmad2/3的mRNA和蛋白水平表达显著升高，提示TGF－β1激活了HGEnC的TGF－β1/Smad信号通路。ILK是一种存在于细胞胞质中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是参与细胞内外信号传导通路形成的重要介质，调节细胞黏附、生存、分化和凋亡［8］。本研究中TGF－β1与HGEnC共同培养后ILK的 mRNA和蛋白水平表达显著升高，提示ILK参与HGEnC的End－MT过程。肾小管上皮细胞发生EMT会出现E－cadherin的丢失，以及表达间质细胞特异性的成纤维细胞特异性蛋白FSP－1、α－SMA等，从而转分化为间质成纤维细胞［9］，在本研究我们也观察到HGEnC的EndMT过程出现类似现象。

综上所述，TGF－β1可促进肾小球内皮－间充质细胞转分化，TGF－β/Smad信号通路参与了该过程，ILK是其重要的下游效应因子，可能在肾脏纤维化过程发挥重要作用。

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