毕 艳,伊正君,付玉荣
(潍坊医学院/山东省临床检验诊断学高校重点实验室,山东潍坊261031)
潜 伏 结 核 感 染(latent mycobacterium tuberculosis infection,LTBI)通常是指体内(通常是肺)存在结核杆菌,但仍未出现明显的症状且痰中也无结核菌,当机体免疫力下降时可由潜伏感染转化为活动性结核感染。据世界卫生组织估计,全球有将近三分之一的人感染过结核分枝杆菌,而全国第4次结核病流行病学调查结果显示,中国感染结核杆菌的人数超过了5亿,占总人口总数的44.5%[1]。潜伏性感染者如果不进行治疗,约有5%~10%将会发展成活动性结核,在伴有免疫抑制疾病的人群中,这一比例更大[2]。免疫抑制剂(激素或者生物制剂TNF-α)已经成为慢性炎症性疾病(如类风湿关节炎、强直性脊柱炎、或克罗恩病等)有效的治疗方法。然而,接受免疫抑制剂患者诱发活动性结核的风险将大幅增加。因此,对应用免疫抑制剂患者进行筛查和预防性治疗是必不可少的。临床上尚缺乏诊断潜伏性结核的“金标准”。结核菌素皮肤试验(TST)因以其成熟的检测手段、低成本,成为目前高危人群潜伏性结核感染的检测方法。但是多因素可影响TST的检测结果,导致出现假阴性和假阳性结果,如机体处于反应前期、病毒和支原体感染性疾病、结核菌素保存不当、剂量不足、注射过深、阅读记录偏差、与卡介苗发生交叉反映等[3,4]。近年来发展的酶联免疫斑点法T-SPOT.TB技术是一种基于抗原特异性细胞免疫应答反应的新型免疫检测技术,为早期诊断结核潜伏感染提供了新的方向。为此,本文对T-SPOT.TB技术在应用免疫抑制剂前患者潜伏结核感染筛查中的应用价值进行评估。
1.1 一般资料 选择2010年8月至2013年12月在某院风湿免疫科住院治疗患者162例,男89例,女7例,年龄(38.6±3.8)岁。结缔组织病98例,其中风湿或类风湿性关节炎77例,皮肌炎4例,白塞综合征7例,其中合并贝赫切特血管病5例且行外科手术治疗;红斑狼疮10例;强直性脊柱炎54例;克罗恩病7例。排除确诊的肺结核患者,肺结核确诊要求:痰涂片或培养出结核分枝杆菌;或根据临床表现、实验室检查临床诊断为肺结核。免疫抑制剂的应用纳入标准:所有应用免疫抑制剂的患者在应用前均行T-SPOT.TB检查,TST试验。
1.2 T-SPOT.TB检测 T-SPOT.TB检测采用英国 Oxford Immunotee公司生产的试剂盒。每个入选患者用BD公司生产的CPT真空采血管采集外周血8mL,室温放置不超过4h,不得冷藏和冷冻。实验过程严格按照试剂盒操作说明书进行。显微镜或放大镜进行斑点计数。当测试孔A或B达到以下标准则判定为阳性结果:(1)阴性对照斑点数为0~5个,A或B孔斑点数-阴性孔斑点数为6个,判断为阳性(+);(2)阴性对照斑点数26,A或B孔斑点数22倍阴性孔,判断为阳性(+);若A、B孔斑点数不够以上标准,且阳性对照反应良好,则为阴性(-)。若阴性对照孔斑点数超过10,阳性对照孔斑点数低于20时,结果不能确定。阳性结果说明患者体内存在针对结核杆菌的效应T淋巴细胞,阴性结果提示患者可能不含针对结核杆菌的效应T淋巴细胞。
1.3 TST检测 采用成都生物制品研究所生产人型结核菌素纯蛋白衍生物(purified protein derivative,PPD)试剂,对所有入选患者以0.1mL PPD(含BCG-PPD 5IU)采用孟都氏法于左侧前臂内侧皮内注射,使局部形成皮丘。48~72h测量皮肤硬结直径,硬结平均直径=(横径+纵径)/2。按照标准OT试验判定标准进行判断,<5mm阴性(-),5~<10mm弱阳性(+),10~<20mm阳性(++),≥20mm或出现破溃,水泡,双圈强阳性(+++)。
1.4 随访 对应用T-SPOT.TB筛查阳性的28例患者,在应用抗TNF-α生物制剂治疗前均给予预防性抗结核药物治疗4个月,并随访1年。
1.5 统计学处理 应用SPSS16.0统计软件进行分析,计数资料用率表示,采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 T-SPOT.TB及TST试验检查应用免疫抑制剂患者阳性率比较 162例患者中,T-SPOT.TB阳性例数为59例,阳性率为36.4%;TST阳性例数为46例,阳性率为28.4%,两者比较差异有统计学意义(P<0.05),见表1。
表1 T-SPOT.TB及TST试验阳性率
2.2 T-SPOT.TB及TST试验检查应用免疫抑制剂患者确诊率比较 59例T-SPOT.TB阳性患者中,确诊为结核感染56例,确诊率为94.9%;46例TST阳性患者中,确诊为结核感染32例,确诊率为69.6%;两者比较差异有统计学意义(P<0.05),见表2。
表2 T-SPOT.TB及TST试验确诊率
2.3 T-SPOT.TB技术筛查后应用免疫抑制剂患者管理 鉴于T-SPOT.TB阳性患者爆发结核感染率较高(94.9%,56/59),有28例应用抗TNF-α生物制剂治疗且T-SPOT.TB阳性患者被纳入,对于LTBI患者,给予目标性治疗方案(包括单用异烟肼、异烟肼和利福平联用、利福平和吡嗪酰胺联用等,持续4个月。在药物治疗过程中严密监测患者的肝功能,一旦出现肝炎临床表现,立即停药。28例患者应用抗TNF-α生物制剂治疗,治疗前均给予预防性抗结核药物治疗4个月,在1年的随访过程中,28例患者其中2例爆发肝炎,停抗结核药物治疗,其中1例死于肝功能衰竭。所有患者均未发生结核感染。
结核病是全球主要的公共卫生问题之一,严重危害人类的健康。据世界卫生组织估计全球约有1/3的人口接近2亿人是潜伏性结核的感染者。我国是世界上22个结核病高负担国家之一,结核病患者数量居世界第2位,全国约有肺结核病患者450万人,每年因患结核病死亡的人数达到13万人[5]。因此早期发现及时确诊结核病在控制结核病措施中显得极为重要。目前临床上免疫抑制剂制剂已经成为慢性炎症性疾病有效的治疗方法。但是应用免疫抑制剂,导致机体细胞免疫功能下降,包括淋巴细胞、单核、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸粒细胞等功能的抑制,容易引发潜伏结核分支杆菌感染,引起活动性结核。我国目前很多医院特别是基层的医院没有对需要应用免疫抑制剂的患者并发潜伏结核感染引起足够的重视,有的医院仅做TST筛查,有的根本就没筛查,从而导致应用免疫抑制剂诱发结核病[6-7]。
TST是诊断LTBI的传统方法,但影响因素很多,导致阳性率并不高,张然等回顾性分析了2 682例SLE应用免疫抑制剂患者中93例患结核,93例TST试验强阳性仅13例(13.98%),阴性高达80例(86.02%)[8]。Xie等[9]采用 Meta分析法对国内常见3种生物制剂治疗RA过程中发生感染、重症感染以及结核感染等的风险进行系统评价。发现涉及的14例结核患者在使用生物制剂前的结核筛查项目为TST皮试、胸部平片等传统手段,筛查结果均为阴性,说明了传统结核检测手段并不能有效发现潜伏性结核患者,达不到早期诊断的目的。
T-SPOT.TB检测原理是利用结核分枝杆菌RD1区域编码的6×103早期分泌抗原靶分子蛋白和10×103培养滤液蛋白的肽段作为特异性抗原,刺激T细胞释放γ-干扰素,再分别通过酶联免疫斑点试验和全血酶联免疫吸附试验检测γ-干扰素水平来判断是否存在结核分枝杆菌感染。T-SPOT.TB技术是目前检测抗原特异性T细胞最敏感的方法,可检测出1/100 000~1/50 000外周血单个核细胞中经某种抗原刺激后释放某种细胞因子的细胞,在2008年,美国FDA已将TSPOT作为第4种IGRAs批准使用。Mandalakas等[10]比较T-SPOT.TB与TST对诊断的准确性,得出IGRAs在诊断潜伏性结核感染时比TST有更大的优势,而且在排除结核感染中可信度更大。本研究也说明T-SPOT.TB在潜伏性结核感染诊断的准确性上要优于TST。
日本Takeuchi等[11]报道5 000例使用英夫利西单抗治疗的RA患者中,前2 000例RA患者中结核发病数为11例,由于加强对后3 000例患者的结核筛查和预防性治疗,结核发病例数由11/2 000例减少至3/3 000例。因此,本研究中遵循了专家组建议,对潜伏结核感染的患者,在使用免疫抑制剂前,先行预防性抗结核治疗至少4个月[12]。通过对28例高危患者(T-SPOT.TB筛查阳性),给予预防性治疗的患者1年的随访,无一例结核病发生,这与国外相关研究结果是一致的[9,11-12]。所以对 T-SPOT.TB阳性的患者给以抗结核药物的预防性治疗非常必要的。
由于目前LTBI的诊断缺乏金标准,惟一能证实的较好方法就是对未经治疗的阳性个体进行随访,这在临床研究中是难以实现的。在应用免疫抑制剂前对潜伏结核感染的筛查就具有重要的临床价值。T-SPOT试验具有较高的特异性和敏感性,是目前快速筛查LTBI感染最有潜力的新方法。本研究认为对于T-SPOT.TB阳性的患者给以预防性的抗结核治疗,加强免疫抑制剂(尤其生物制剂)使用前对潜伏性结核感染的检测和预防性治疗,可有效且最大程度减低免疫制剂致结核感染风险。对T-SPOT.TB确诊的阳性LTBI患者给予预防性抗结核药物治疗也是非常必要的。
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