盐酸吸入联合机械通气建立暴喘症大鼠模型

2015-03-18 07:48黄小红黄红坤刘盛来许惠英唐小江
中国兽医杂志 2015年6期
关键词:动物模型肺泡盐酸

黄小红,黄红坤,孙 侠,刘盛来,许惠英,唐小江

(广东省医学实验动物中心,广东 佛山 528248)

急性呼吸窘迫综合征(暴喘症)病因复杂,胃内容物误吸是临床常见病因之一,其发病率逐年升高,死亡率高达40%左右。事实上,对暴喘症的很多研究都是在动物急性肺损伤模型上进行的。根据致病因素研制模型,再根据模型研究其病理生理变化过程并拟定治疗方案[1]。因此,模拟临床常见病因建立相应的动物模型具有非常重要的意义。目前建立理想的误吸所致暴喘症动物模型是研究得以深入的关键。以往主要通过单纯盐酸吸入、盐酸酸化后人乳滴入等方式制备该动物模型,损伤局限于肺部,难以造成呼吸窘迫程度。本研究模拟临床误吸病因,采用盐酸吸入,同时联合机械通气的方法,使动物出现急性呼吸窘迫综合征,为进一步开展误吸造成的暴喘症研究提供工作平台。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF 级SD大鼠,30 只,雄性,8~10周龄,体重300~350 g,购自广东省医学实验动物中心,实验动物质量合格证明编号:4407208423。实验动物的使用经本中心实验动物伦理委员会审查通过。

1.2 饲养条件 大鼠饲养于广东省医学实验动物中心SPF 级动物房,实验动物使用许可证号SYXK(粤)2013-0002。饲养温湿度为20 ℃~26 ℃、40%~70%,采用10 h:14 昼夜间断照明。喂以大鼠维持饲料(来自广东省医学实验动物中心),自由进食饮水。

1.3 仪器与试剂 HX-300S动物呼吸机,成都泰盟科技有限公司,LXJ-2B离心机,上海安亭科学仪器厂,CX21 生物显微镜,日本奥林巴斯厂,RM2135 轮转切片机,德国LEICA公司,RS-18 生物组织全自动染色机,湖北孝感医用仪器有限公司,BX41 病理图像分析系统,日本奥林巴斯厂,浓盐酸,批号20110901,广州化学试剂二厂生产。

1.4 试验方法 将检疫合格的30 只SD大鼠按体重随机分为正常对照组、小通气量模型组、大通气量模型组,10 只/组。(1)除正常对照组外,大鼠用2%戊巴比妥钠按60 mg/kg 体重腹腔注射麻醉后,75%酒精消毒剃毛部位,手术依次剪开皮肤,分离暴露气管。接着,向气管注入0.1 mol/L 盐酸;(2)随后进行气管插管,连接呼吸机通气(小通气量模型组通气量为6 mL/kg 体重,大通气量模型组通气量为15 mL/kg 体重);(3)连续通气6 h后放血处死大鼠,剖检取左右肺组织。

指标检测:(1)右上肺组织进行肺泡灌洗,所得肺泡灌洗液(BALF)4 ℃1 000 r/min 离心10 min,去上清后,无菌生理盐水重悬,细胞涂片并进行瑞氏染色,用血细胞计数器进行细胞分类计数灌洗液嗜中性粒细胞占白细胞分类百分比;(2)对左肺组织计算左肺组织湿干重比:置于60 ℃干燥箱中连续干燥48 h。左肺肺组织湿干重比=左肺肺组织干燥前重量/干燥后重量,即为左肺含水量;(3)组织病理学检查:右肺4%多聚甲醛固定后,常规取材、脱水、石蜡包埋、切片,H.E.染色、封片,显微镜下阅片进行组织病理学检查。

1.5 统计分析 各检测指标数据以均数加减标准差表示(X±s),采用SPSS21.0 统计软件方差分析、秩和检验等统计方法进行组间差异的显著性检验。

2 结果

2.1 动物观察 造模后,小通气量模型组大鼠呼吸频率加快,出现轻度呼吸窘迫症状,大通气量模型组大鼠呼吸频率加快,出现中重度呼吸窘迫症状,口唇及指端发绀;正常对照组大鼠无异常。

2.2 左肺组织湿干重比 与正常对照组比较,小通气量模型组、大通气量模型组大鼠左肺组织湿干重比显著高于正常对照组(P<0.05、P<0.01),见表1。

2.3 肺泡灌洗液嗜中性粒细胞占白细胞比例

表1 大鼠左肺组织湿干重比及肺泡灌洗液嗜中性粒细胞占白细胞比例结果

与正常对照组比较,小通气量模型组、大通气量模型组大鼠肺BALF 液嗜中性粒细胞占白细胞比例显著高于正常对照组(P<0.01),见表1。

2.4 肺部组织病理学观察 剖检大鼠,正常对照组大鼠正常对照组肺脏表面光滑、无出血点、质软。小通气量模型组大鼠肺脏点状出血或小片状出血、质软。大通气量模型组大鼠肺脏黑褐色或鲜红色、肿大、大片状出血或全肺出血。光镜下200 倍所见如中插彩版图1。

3 讨论

暴喘症病因复杂,有100 多种疾病可并发暴喘症,但大致可分为直接原因和间接原因两大类,分别为肺源性暴喘症和肺外源性暴喘症。据此,动物模型亦可分为肺内型和肺外型。其中肺内型包括盐酸吸入型,从气管内注入0.1 mL 盐酸(1 mL/kg)可使麻醉后动物发生ALI(急性肺损伤)。盐酸吸入肺模型常被用作吸入性肺炎的试验研究,研究表明[2-3],向家兔气管注入盐酸后,引起肺泡-毛细血管膜损伤。盐酸也可损伤PS(肺表面活性物质)系统,出现暴喘症的临床特征。实际上,此种模型虽然循环功能稳定,但组织损伤基本局限于肺部,是对胃内容物的误吸所致ALI 的模拟,而不足于切实形成暴喘症模型。Hare 等(1999)给兔气管内分别滴入人乳、盐酸酸化后的人乳建立了ALI 模型,与单纯盐酸吸入所致的ALI 模型比较,在炎性介质、病理改变等方面无明显差别。另一种肺内型为机械通气相关肺损伤,用20 mL/kg 的潮气量、85 次/min 的呼吸频率,2 h 可诱发大鼠的肺损伤[4]。其致病机制在于肺组织的过度膨胀造成的血管透壁压和渗透性增加,大致包括加剧炎性反应、促进细胞凋亡、改变肾性细胞核苷酸和嘌呤受体的表达几个方面,焦点在于是否有炎性因子参与肺损伤及参与的程度[5]。总之,机械通气导致的血流动力学及神经体液系统的改变在暴喘症的发生中起着重要作用。目前另有报道[6]说明机械通气是治疗暴喘症的重要手段,目前常采用低潮气量(6 mL/kg)的机械通气模式,已有多项研究表明可能更加有利于暴喘症患者的恢复。因此,采用机械通气用于动物模型的制备时,准确把握机械潮气量是重点和难点。

在临床上,误吸导致急性肺损伤的影响因素甚多,形成机制比较复杂。盐酸作为一种强酸性化学物质,对肺可产生直接的损害,使肺泡上皮和肺毛细血管通透性增加,发生出血、坏死、淤血等病理改变,可作为对胃内容物的误吸所致暴喘症的模拟[7]。

综上所述,本研究成功建立了误吸造成的暴喘症大鼠模型。将盐酸作为造模药模拟临床胃内容物误吸造成的暴喘症,同时联合机械通气,使动物出现急性呼吸窘迫综合征,改变以往主要通过单纯盐酸吸入、盐酸酸化后人乳滴入等方式制备误吸的急性肺损伤模型,损伤局限于肺部,难以造成呼吸窘迫程度的情况,更具可行性和稳定性,从而涉及更广范围的误吸病人,也更接近于临床实际,通过成功建立误吸造成的暴喘症大鼠模型,为进一步开展误吸造成的暴喘症研究提供工作平台。

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