MKK4 蛋白在鼻咽癌组织中的表达及临床意义①

鲁明骞 孔庆志 许新华 卢宏达 卢忠心 谭 超 徐冰清 郭 蓉

(三峡大学第一临床医学院肿瘤研究所＆湖北省宜昌市中心人民医院肿瘤内科，宜昌 443003)

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我国最常见的恶性肿瘤之一，好发于我国南方各省，素有“广东瘤”(Canton tumor)之称，世界上80%的鼻咽癌发生在我国，占头颈部恶性肿瘤的首位。各个年龄组均可发病，以30～60 岁多见，占75%～90%，男性发病为女性的(2～3.8)∶1。目前鼻咽癌的治疗主要以放射治疗为主，化疗虽有较高的缓解率，但完全缓解率低，而且有较重的不良反应，新辅助化疗及辅助化疗对鼻咽癌患者生存率的影响尚无定论。分子靶向治疗主要针对导致细胞癌变的环节，开创了肿瘤内科诊断和治疗相结合的新时代，同时提高了患者的有效率及生存率。丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPKs)是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其信号传导存在于大多数细胞内，在其受到刺激后可将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，对细胞增殖、分化、转化、凋亡、血管形成、肿瘤转移等有一定调控效应［1］。MKK4(Mitogen-activated protein kinase kinase 4)是MAPK 的激酶，作为MAPK 信号传导通路的构成部分，是Ras 癌基因信号传导通路的中心环节，通过对细胞内、外信号刺激的调节作用，从而对肿瘤细胞的生长、增殖、凋亡和转移等有一定的调节作用［2］。本研究以鼻咽癌患者为研究对象，测定MKK4 蛋白的表达，研究其蛋白表达水平与鼻咽癌的相关性，初步探讨鼻咽癌MKK 蛋白表达与生物学行为、侵袭转移、治疗、预后等的关系，希望通过本研究有助于对恶性肿瘤信号转导机制的进一步了解，为鼻咽癌的预防与治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集我院2002 年1 月至2009 年12 月鼻咽癌患者的石蜡组织标本90 例，其中男性62 例、女性28 例，年龄22～73 岁，平均(45.3±5.2)岁。鼻咽癌分期采用福州92 分期标准，其中低分化鳞癌85 例，未分化癌5 例，全部病人均为初诊，行常规放射治疗，中晚期病人辅以DDP+5-FU 诱导方案化疗。收集同期病理结果为鼻咽慢性炎症组织石蜡标本20 例作为对照组。所收集资料的内容主要为年龄、性别、淋巴结转移、临床分期、分化程度等。

1.2 试剂与方法 将石蜡包埋的组织标本制备成4 μm 厚的连续切片，贴于经多聚赖氨酸处理过的载玻片，50℃恒温箱烤片过夜，经组织切片脱蜡、水化，滴加适量新鲜配制的3%过氧化氢溶液，室温下孵育10 min 以消除内源性过氧化物酶的活性，蒸馏水洗3 min×3 次，PBS 缓冲液浸泡5 min。高温高压抗原修复:将切片置入0.01 mol/L 柠檬酸缓冲液(PH6.0)中，高压锅加热至喷汽1 min，自然冷却后取出切片，蒸馏水洗3 min ×2 次，滴加正常山羊血清封闭液，室温20 min。甩去多余液体，滴加MKK4单克隆抗体(1∶80)，4℃过夜后在37℃复温45 min，PBS 洗涤2 min ×3 次，滴加生物素化二抗，37℃20 min，PBS 洗涤2 min×3 次，滴加试剂SABC，37℃20 min，PBS 洗涤5 min×4 次，加DAB 显色剂，显色10 min，苏木素轻度复染，0.5%盐酸酒精分色、脱水、透明、中性树胶封片，显微镜观察。

1.3 结果判断 MKK4 蛋白阳性信号定位于细胞质，少数位于细胞核，呈棕黄色。在400 倍光镜下观察每张切片，选取具有5 个代表性的不同视野进行观察，根据MKK4 阳性细胞浆或细胞核的染色细胞阳性染色强度及阳性细胞数进行综合分析评分:根据阳性染色强度进行半定量积分法判断，将结果分为四个级别:0(Negative，无染色);1(Weak staining，弱阳性);2(Moderately increased staining，黄色);3(Intense staining，棕黄色者)。0 为光镜下看不到明显的染色结果;1 为染色散在单个细胞内或者是鳞状上皮弱的扩散染色，染色为浅黄色者;2 为染色呈黄色，阳性结果主要出现在胞浆和/或细胞核;3 为染色呈棕黄色者，并且大面的出现在病灶部位。阳性细胞数:无阳性细胞表达，计0 分;阳性表达细胞≤25%，计1 分;25%≤阳性细胞数≤50%，计2分;阳性表达细胞数＞50%，计3 分。上述两种判断标准得分乘积为最终计分结果:0 分为阴性;1、2、3、4、6、9 为阳性。最终结果由染色的总数和染色强度共同决定，总值0 表示阴性，0～2 为弱阳性，3～4 为中等阳性，6～9 为强阳性，≤2 为低表达，＞2 为高表达。

1.4 统计学方法 所有数据用SPSS13.0 统计软件进行分析处理。阳性率之间的比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearman 等级相关，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

免疫组化的切片均由经验丰富的病理科医师阅片，评价主要是基于蛋白质表达的阳性细胞染色强度与阳性细胞数进行综合评分。

2.1 MKK4 蛋白在鼻咽癌组织和鼻咽慢性炎症组织的表达 免疫组化结果表明，MKK4 蛋白在鼻咽癌组织中阳性表达率为75.6%(68/90)，鼻咽慢性炎症组织中阳性表达率为95.5%(19/20)，差异有统计学意义(P ＜0.05)，且鼻咽癌组的MKK4 蛋白的阴性细胞数(-)22 人，占24.4%，(+)为14 人，占15.6%，(++)为31 人，占34.4%，(+++)为23 人，占25.6%;对照组的MKK4 的阴性细胞数(-)1 人，占5.0%，(+)为3 人，占15.0%，(++)为6 人，占30.0%，(+++)为10 人，占50.0%，见表1。

表1 MKK4 在鼻咽癌及鼻咽慢性炎症组织中的表达Tab.1 MKK4 expression in NPC and chronic nasopharyngitis tissues

2.2 鼻咽癌组织中MKK4 蛋白表达与临床病理特征关系 MKK4 蛋白在低分化癌与未分化癌中的高阳性表达率分别为67.5%和0%，两组比较差异有统计学意义(P ＜0.05)，T1-T2 鼻咽癌组织阳性高表达为51.3%(20/39)，在T3-T4 鼻咽癌组织中的阳性高表达为66.7%(34/51)，差异无统计学意义，(P ＞0.05)，无淋巴结转移组织中细胞阳性高表达为76.7%(46/60)，有淋巴结转移组织中细胞阳性高表达为26.7%(8/30)，差异具有统计学意义(P＜0.01)，在临床Ⅰ-Ⅱ期的阳性高表达为73.6%(39/53)，临床Ⅲ-Ⅳ期的阳性高表达为40.5%(15/37)，差异具有统计学意义(P ＜0.05)。MKK4 蛋白在男性鼻咽癌组织中高表达为53.2%(25/47)，在女性鼻咽癌组织中的高表达为67.4%(29/43)，年龄≥50 岁阳性高表达为64.5%(40/62)，年龄＜50岁阳性高表达50.0%(14/28)，病灶在咽隐窝阳性高表达为67.1%(47/70)，发生在顶后壁为35.0%(7/20)，结果显示不同年龄、性别、原发部位、T 分期鼻咽癌组织中MKK4 高表达差异均无统计学意义(P ＞0.05)(见表2)。

表2 MKK4 蛋白在鼻咽癌组织中的表达与临床病理特征的关系Tab.2 Relationship MKK4 protein expression in nasopharyngeal carcinoma and clinicopathological features

2.3 MKK4 蛋白表达与预后的关系 复发时间≤5年患者共28 例，MKK4 阳性高表达13 例(46.4%)，复发时间＞5 年共30 例，阳性高表达22 例(73.3%)(P ＜0.05)，提示MKK4 蛋白在鼻咽癌组织中表达越高，TTP(5 年至疾病进展时间)越长。

3 讨论

鼻咽癌是头部最常见的恶性肿瘤，近年来鼻咽癌的发病呈逐渐上升趋势，尤其是在我国的南方地区比较普遍，因此越来越受到人们的关注。面对常规的高强度治疗效果不理想且副作用大的难题，针对细胞信号途径的分子靶向药物开创了肿瘤治疗的新时代。

MAPK 是细胞信号传导通路中常见的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其所涉及的4 条通路对于维持细胞的正常生理过程，尤其是细胞分裂和凋亡，具有重要的生物学意义［3］。当细胞生长和凋亡的平衡被打破时，就会导致肿瘤的发生甚至无限制生长。MKK4 主要分布在细胞质中，少数分布于细胞核。MKK4 作为MAPK 信号传导通路的重要组成部分，是癌基因Ras 信号传导通路的中心环节，在肿瘤的发生、发展中起着非常重要的调节作用［4］，能同时磷酸化并激活2 条MAPK 信号传导通路，即JNK 通路和p38 通路，能将细胞外信号传导至细胞及其核内，引起细胞生物学反应。本研究的结果表明，鼻咽癌患者中MKK4 蛋白的高表达率明显低于鼻咽慢性炎症组织中MKK4 蛋白高表达率，由此推测肿瘤细胞中可能存在MKK4 受体过度表达，通过信号级联反应，使得细胞MKK4 生长受到抑制，出现肿瘤细胞失控性生长，证明MKK4 蛋白的高表达在一定程度上抑制了鼻咽癌的发生和发展。与对照组相比，鼻咽癌组的MKK4 蛋白的阳性表达率下调，随着鼻咽癌的恶化，MKK4 蛋白的表达减少，且均与对照组有差异，但仅Ⅰ期、Ⅱ期与Ⅲ期、Ⅳ期有显著性差异，而Ⅰ期、Ⅱ期的MKK4 蛋白表达水平最高，在鼻咽癌发展的过程中，MKK4 的表达呈现下降的趋势，且Ⅲ期、Ⅳ期的表达水平最低。以上结果表明MKK4 蛋白的表达水平与鼻咽癌分期呈负相关。MKK4 蛋白在有淋巴结转移、分化程度较差的组织中的高表达率明显低于无淋巴结转移、分化程度相对较好的组织，但不同年龄、性别、原发部位、T 分期并不影响MKK4 蛋白的阳性高表达率，无统计学差异。

MKK4 基因在肿瘤信号传导中具有重要调节作用，其在肿瘤的发生发展过程中是具有正性还是负性调节作用目前还存在较大争议。在本研究中，我们通过免疫组化方法测定鼻咽癌及鼻咽慢性炎症组织中的MKK4 蛋白表达情况，结果显示MKK4 蛋白在鼻咽癌组织中的表达量明显低于鼻咽慢性炎症组织中的表达量，其原因可能是由于细胞微环境发生变化产生应激而使得MKK4-JNK 或/和MKK4-P38通路被激活。MKK4 蛋白在鼻咽癌组织中的高表达率明显降低，说明MKK4 蛋白表达率下调可能是鼻咽癌发生的早期分子事件，甚至可能是始动因素之一，与刘斌等［5］研究结果一致。本研究显示复发时间≤5 年患者MKK4 蛋白阳性高表达率明显低于生存期＞5 年患者阳性表达率(P ＜0.05)，提示MKK4蛋白在鼻咽癌组织中表达越高，5 年至疾病进展时间(TTP)越长，与患者的预后有一定关系。Teng等［6］研究发现胰腺癌细胞株、乳腺癌细胞株、结肠癌细胞株和睾丸癌细胞株的MKK4 突变率约为3%，这些发现表明在某些癌细胞类型中MKK4 基因可能具有抑癌作用。Cunningham 等［7］发现胃癌患者手术切除胃腺癌标本中缺乏MKK4 蛋白表达的生存期较短，多变量研究分析显示原发胃腺癌标本中MKK4 阴性的患者死亡危险性增加5 倍。Stark等［8］运用RT-PCR、免疫组化技术检测乳腺导管癌及其脑部转移灶中MKK4 基因及其蛋白表达情况，发现转移灶与原发灶相比，MKK4 的表达下降达10倍，证明了MKK4 与乳腺癌脑转移的负相关性。

但也有研究相反的结果，Wang 等［9］将缺乏内源性MKK4 的乳腺癌和胰腺癌细胞株转染使其分别表达MKK4 基因，结果显示癌细胞的增殖及侵袭能力得到提高。然而，通过RNA 干扰技术敲除MKK4 阳性的乳腺癌细胞株MDA-MB-231 的MKK4基因后，结果导致癌细胞非停泊性生长速度下降。Wu 等［10］用免疫组化方法分析发现在胃腺癌组织中表达MKK4 蛋白的患者和胃腺癌组织中不表达MKK4 蛋白的患者相比，前者有较差的无复发生存率和总的生存期。此外，最近还有学者报道MKK4能通过激活核因子κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)而抑制细胞凋亡，但具体MKK4 是如何激活NF-κB 来抑制细胞凋亡的，其机制尚不清楚［11，12］。

为什么会存在这些自相矛盾的结果呢?主要原因可能为实验时所采用的不同组织、细胞类型以及实验模型的特异性所致。不同的肿瘤组织、相同肿瘤组织不同的发展阶段，MKK4 的表达水平及其所诱导的生物学效应可能都具有组织特异性，从而导致了矛盾结果的出现。而且，在实验时敲除细胞的MKK4 基因和细胞自然发生MKK4 基因丢失是不同的，实验时MKK4 基因的丢失是实验者强加于细胞的，而细胞自然发生的MKK4 基因丢失是基于细胞周围自然环境选择的结果。还有可能在不同的环境中检测MKK4 的肿瘤抑制能力时，由于存在一些与转移能力无关的影响因素，这些都可导致不同的结果［13］。

综上所述，MKK4 蛋白的异常表达可能在鼻咽癌的发生、发展过程中起重要作用。可用MKK4 蛋白的表达水平来预测患鼻咽癌的风险。因此，MKK4 可以作为一个潜在的判断鼻咽癌发病与转移的观测指标，并可能为鼻咽癌的临床治疗提供新靶点。

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