鸡蛋白提取液诱导细胞后干细胞蛋白芯片分析①

阮光萍 姚 翔 刘菊芬 王金祥 李自安 胡媛媛 潘兴华

(成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心，昆明 650032)

发现一种提取液能促进体细胞向干细胞转变将在再生医学研究中有重要的意义。有文献报道动物的卵细胞提取液能重新编程体细胞，包括猪的卵细胞［1］和非洲爪蟾的卵细胞［2，3］提取液都能使体细胞核重编程。在这个研究中，我们用鸡蛋白提取液作用于不同细胞，共培养3 d 后，收集细胞，送公司做干细胞蛋白芯片检测，现将研究报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞来源 4 种细胞为我们实验室经常培养的细胞，C57 小鼠的骨髓间充质干细胞(C57-BMSC)(自己制备)，树鼩的脐带间充质干细胞(TS-UCMSC)(自己制备)，293T 细胞(购自中国科学院昆明细胞库)和GFP 慢病毒转染成功的293T 细胞(293T-GFP)(自己转染成功)。

1.2 鸡卵清提取液的制备 取几个鸡卵，无菌分离卵清和卵黄，卵清按1∶1 加裂解液，充分搅匀，存放于-20℃。冻融3 次后，离心，取上清，4℃保存。裂解液配方:50 mmol/L NaCl，5 mmol/L MgCl2，100 mmol/L HEPES，pH8.2，1 mmol/L 二 硫 苏 糖 醇(DTT)，0.1 mmol/L 苯甲基磺酰氟(PMSF)和蛋白酶抑制剂。由此得到的提取液为鸡卵清提取液。获得的提取液用50%的终浓度与293T 细胞共培养3 d，然后用定量PCR 的方法检测细胞多能基因OCT4和NANOG 与对照(培养基培养)相比明显升高，即为质控指标合格，可用于下面的实验。

1.3 干细胞蛋白芯片检测步骤 每个芯片孔中加入100 μl 的1 ×封闭液，室温摇床上孵育30 min，避免产生气泡;抽去封闭液，每个孔中添加100 μl 样品，一个阵列一个样品;4 ℃振荡过夜孵育。使用Thermo Scientific Wellwash Versa 芯片洗板机清洗玻片，每孔加入70 μl 生物素标记抗体;室温震荡孵育1～2 h，清洗，每孔加入70 μl 的1 500 倍稀释的荧光剂-链霉亲和素，用密封条贴住玻片，然后用铝箔纸包住玻片避光室温震荡孵育1～2 h。清洗，采用激光扫描仪例如Axon GenePix 扫描信号。采用芯片分析软件提取数据，对于Fold change，选取大于1.5 为有统计学意义。

1.4 Western blot 检测多能标志蛋白OCT4 和NANOG 兔抗人OCT4 多克隆抗体购自Immunoaway 公司，鼠抗人NANOG 单克隆抗体购自Millipore公司，二抗均购自碧云天生物技术有限公司。293T细胞在6 孔板中，一孔加培养基，一孔加50%终浓度的鸡蛋白提取液，共培养3 d 后，用碧云天的IP细胞裂解液提细胞蛋白，取50 μl 细胞蛋白液加10 μl 6 ×的上样缓冲液，100℃水浴5 min，上样20 μl，进行SDS-PAGE 电泳，电泳结束后，100 v 电压转膜1 h，膜用5%脱脂奶粉的TBS 封闭37℃1 h，将一抗1∶250 稀释于2%脱脂奶粉的TBS 中，37℃振摇1 h，TTBS 洗3 次，每次5 min，二抗1∶200 稀释于2%脱脂奶粉的TBS 中，37℃振摇1 h，TTBS 洗3 次，每次5 min，ECL 显色，用Tanon 的化学发光成像仪检测发光条带。

2 结果

2.1 C57-BMSC 有3 个蛋白发生了统计学意义的改变 SOX17、BMPR-1A 和NANOG 是干细胞中表达的蛋白，当体细胞向干细胞转变后细胞中这几个蛋白的表达升高，我们用50%终浓度的鸡蛋白提取液与C57-BMSC 共培养3 d 后，这几个蛋白的表达明显升高，说明C57-BMSC 又向更多能的干细胞分化了，见图1。

2.2 TS-UC-MSC 有1 个蛋白发生了统计学意义的改变 BMPR-1A 是干细胞多能性的标志，TS-UCMSC 用50%鸡蛋白提取液共培养3 d 后，与未加鸡蛋白提取液培养的细胞相比，BMPR-1A 明显升高，说明细胞又向多能干细胞的方向分化了，见图2。

2.3 293T 有1 个蛋白发生了统计学意义的改变 BMPR-1A 是干细胞多能性的标志，293T 细胞是标准的体细胞株，用50%鸡蛋白提取液共培养3 d 后，BMPR-1A 表达明显升高，说明293T 细胞有向干细胞转变的现象发生，见图3。

2.4 293T-GFP 有1 个蛋白发生了统计学意义的改变 OCT4 是干细胞多能性的标志，293T-GFP 用50%的鸡蛋白提取液共培养后，对比培养基培养的细胞OCT4 的表达明显增加，说明细胞有向干细胞转化的现象。

图1 C57-BMSC 有3 个蛋白发生了统计学意义的改变(n=3)Fig.1 C57-BMSC has three proteins occurred statistically significant change(n=3)

图2 TS-UC-MSC 有1 个蛋白发生了统计学意义的改变(n=3)Fig.2 TS-UC-MSC has one protein occurred statistically significant change(n=3)

图3 293T 有1 个蛋白发生了统计学意义的改变(n=3)Fig.3 293T has one protein occurred statistically significant change(n=3)

2.5 293T 细胞OCT4 和NANOG 蛋白的Western blot 结果(图5) OCT4 和NANOG 蛋白是干细胞多能性的标志，293T 细胞用50%的鸡蛋白提取液共培养后，OCT4 和NANOG 蛋白的表达量明显增加(图5 和表1)，与对照组(培养基培养)相比有统计学意义(P＜0.05，n=3)。

图4 293T-GFP 有1 个蛋白发生了统计学意义的改变(n=3)Fig.4 293T-GFP has one protein occurred statistically significant change(n=3)

图5 293T 细胞OCT4 和NANOG 蛋白的Western blot 结果Fig.5 Western blot results of OCT4 and NANOG protein in 293T cells

3 讨论

SOX17、BMPR-1A、NANOG 和OCT4 是干细胞中表达的蛋白，在细胞转化为多能的干细胞时，这几个蛋白的表达明显升高。因此，这些蛋白在细胞中表达明显升高时，可以认为细胞向多能的干细胞发生了转化。

表1 293T 细胞诱导后OCT4 和NANOG 蛋白的相对表达量(n=3)Tab.1 OCT4 and NANOG protein relative expression in induced 293T cells(n=3)

我们用共培养法发现加了50%鸡蛋白提取液的细胞有一些干细胞蛋白表达明显升高，而现在用卵细胞提取液诱导体细胞核重编程的方法，通常用可逆渗透法，即先用链球菌溶血素O(SLO)在细胞膜上打孔，再用卵细胞提取液渗透，最后再用氯化钙再封合细胞膜上的孔，是否这种方法诱导效率更高，需要今后的实验进一步深入研究。

我们在实验中用了4 种细胞，C57 小鼠的骨髓间充质干细胞(C57-BMSC)、树鼩的脐带间充质干细胞(TS-UC-MSC)、293T 细胞(购自中国科学院昆明细胞库)和GFP 慢病毒转染成功的293T 细胞(293T-GFP)，用50% 的鸡蛋白提取液共培养3 d后，均检测到了干细胞相关蛋白表达的升高，说明了鸡蛋白提取液有诱导细胞向多能干细胞转变的现象，因为多能标志蛋白有意义地升高了。

对比猪卵提取液和蟾蜍卵提取液，鸡蛋白提取液获取更方便，获取量更大，提取过程注意无菌操作，获得的鸡蛋白提取液无须过滤除菌就可用于细胞培养，有较大的应用价值。在我们以前的研究中，发现鸡蛋白提取液有促细胞增殖的作用［4，5］，还有促进多能因子OCT4 和NANOG 升高表达的作用［6，7］，因此在本研究中我们进一步应用干细胞蛋白芯片检测更多的多能因子，同时使用4 种细胞，都检测到其中多能因子的升高表达，C57-BMSC 有SOX17、BMPR-1A 和NANOG 这3 个蛋白发生了统计学意义的改变，TS-UC-MSC 有BMPR-1A 蛋白发生了统计学意义的改变，293T 有BMPR-1A 蛋白发生了统计学意义的改变，293T-GFP 有OCT4 蛋白发生了统计学意义的改变，进一步验证了鸡蛋白提取液有诱导体细胞向多能细胞转变的作用。

由于C57-BMSC 和TS-UC-MSC 是间充质干细胞，它们经过诱导后多能因子进一步升高表达，是否证明了鸡蛋白提取液含有某些逆向分化细胞的特殊物质，以及这些物质的鉴定和分离提取还有待实验进一步验证。

［1］Miyamoto K，Tsukiyama T，Yang Y，et al.Cell-free extracts from mammalian oocytes partially induce nuclear reprogramming in somatic cells［J］.Biol Reprod，2009，80(5):935-943.

［2］Hansis C，Barreto G，Maltry N，et al.Nuclear reprogramming of human somatic cells by xenopus egg extract requires BRG1［J］.Curr Biol，2004，14(16):1475-1480.

［3］Miyamoto K，Furusawa T，Ohnuki M，et al.Reprogramming events of mammalian somatic cells induced by Xenopus laevis egg extracts［J］.Mol Reprod Dev，2007，74(10):1268-1277.

［4］阮光萍，王金祥，刘菊芬，等.鸡卵清提取液中小于3kDa 的成分有促细胞增殖的作用［J］.中国细胞生物学学报，2014，36(10):1350-1354.

［5］阮光萍，王金祥，庞荣清，等.鸡卵细胞提取液有维持和增强细胞活性的关键作用［J］.中国细胞生物学学报，2013，35(6):804-809.

［6］阮光萍，王金祥，姚 翔，等.鸡卵提取物促进293T 细胞升高表达多能基因OCT4 和NANOG［J］.中国细胞生物学学报，2014，36(2):190-194.

［7］阮光萍，姚翔，刘菊芬，等.鸡卵清提取液中大于3ku 蛋白促细胞升高表达多能基因Oct-3/4 和Nanog［J］.中国组织工程研究，2014，18(37):6029-6033.