循环miR-145和miR-484在乳腺癌诊断中的研究*

黄远帅,周炜鑫,罗彬瑞,郭天虹

(1.四川医科大学附属第一医院输血科，四川泸州 646000;2.四川医科大学研究生院，四川泸州 646000)



·论 著·

循环miR-145和miR-484在乳腺癌诊断中的研究*

黄远帅1,周炜鑫2,罗彬瑞2,郭天虹2

(1.四川医科大学附属第一医院输血科，四川泸州 646000;2.四川医科大学研究生院，四川泸州 646000)

目的 探索乳腺癌血浆中差异表达的微小RNA(miRNA)，为检测乳腺癌寻找全新的生物标志物，并确定其诊断价值。方法 采用定量反转录聚合酶反应检测训练组30例乳腺癌患者和20例健康对照者血浆中的候选标志物，再盲法验证20例乳腺癌患者和20例健康对照者候选标志物的诊断效能。结果 训练组共发现6个差异表达的miRNA，其中miR-145和miR-484差异最显著，与其他4个差异有统计学意义(P<0.05)。经盲法验证，二者联合诊断可有效区分乳腺癌患者与健康对照患者，受试者工作曲线下面积为0.965，灵敏度和特异度分别为91.3% (95%CI： 85.2%～95.4%)和90.8%(95%CI： 83.7%～93.6%)，阳性预测值为91.0%，阴性预测值为91.0%。结论 血浆中miR-145和miR-484是乳腺癌潜在的诊断标志物。

乳腺癌； 微小RNA-145； 微小RNA-484； 受试者工作曲线下面积； 灵敏度

乳腺癌是由乳腺导管上皮发生的恶性肿瘤，是妇女的常见恶性肿瘤，占99%，男性仅占1%[1]。全球每年约有120万妇女患乳腺癌，50万人死于乳腺癌，我国虽属乳腺癌低发地区，但随着生活水平的提高和家庭人口的简单化，近几年有明显上升的趋势[2]。目前乳腺癌的诊断包括：病理学检查、影像学检查及血清标志物辅助检查。病理活检是乳腺癌诊断的“金标准”，但因为取材和创伤性等限制了它的应用。影像学检查包括乳腺X线摄影(乳腺钼靶照相)、CT、彩超、MRI等，是乳腺癌检测的重要手段，但由于其放射性损伤和假阳性率高，检测费用也偏高，因此不适合常规体检。实验室检测项目有癌胚抗原、糖类抗原153等，但是无论是单项检测还是联合应用，其灵敏度和特异度都不够理想，只能作为一种辅助检查手段[3-4]。因此寻找一种新的，诊断效能高的乳腺癌诊断标志物显得十分重要。微小RNA(miRNA)在人类肿瘤的发生、发展中起十分重要的作用，它们参与细胞的分化、增殖、凋亡、黏附及死亡等生物学过程，这些与癌症的形成及演变都密切相关[5]。近年来，有关miRNA在诊断疾病价值方面的研究越来越受到重视，血清/血浆miRNA表达稳定，检测方便，损伤小，是理想的癌症诊断标志物。已有相关文献报道miRNA在乳腺癌的发生、发展及诊断中的应用[6-9]。本研究旨在寻找乳腺癌的特异生物标志物——miRNA，并评价其在乳腺癌诊断中的价值。

1 资料与方法

1.1 标本收集 收集四川医科大学附属第一医院2011年7月至2014年7月收治的乳腺癌患者50例作为肿瘤组，年龄34～70岁，平均59岁；TNM分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期20例，Ⅲ期18例，Ⅳ期5例。入选条件：(1)女性；(2)病理检查确诊为乳腺浸润性导管癌；(3)未行手术或放、化疗等任何治疗；(4)临床病理资料完整。同时收集门诊体检者40例作为健康对照组，男5例，女35例；年龄35～68岁，平均60岁。将这两组标本分为训练组(乳腺癌患者30例和健康对照者20例，用于筛选具有诊断价值的miRNA)和验证组(乳腺癌患者20例，健康对照者20例，用于鉴别筛选出的miRNA的诊断价值)。肿瘤组血浆标本采集于患者乳腺癌确诊后和治疗前；两组受试者均签署知情同意书。

1.2 定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测训练组候选标志物 先用Trizol试剂提取肿瘤组和健康对照组血浆标本的总RNA，反转录和实时定量PCR技术联合检测训练组50例血浆标本中的miRNA，选择RNU6B (U6)作为内标物质进行标准化(△Ct=△CtmiR-△CtU6)，相对表达量以2-△Ct表示[10]。所用试剂为Taqman human miRNA assay kit，按试剂盒说明书步骤操作。

1.3 统计学处理 组间数据比较采用Mann-Whitney U检验，数据之间两两比较采用Kruskal-Wallis检验，所有数据均采用SPSS18.0统计软件进行统计分析，以P<0.05为差异有统计学意义。利用Graph PadPrism V4.03软件进行数据分析和作图，然后将差异miRNA带入验证组验证其诊断效能[11]。用受试者工作曲线(ROC)及曲线下面积(AUC)比较不同miRNA区分乳腺癌患者和健康者的能力，计算其灵敏度、特异度。

2 结 果

2.1 乳腺癌特异miRNA筛选 乳腺癌组(30例)和健康对照组(20例)共50例标本经qRT-PCR检测，初步筛选出6个显著表达的miRNA(miR-16、miR-21、miR-145、miR-191、miR-210、miR-484)，见表1。除了miR-145在乳腺癌组中表达降低以外，其余都呈高表达，差异有统计学意义(P<0.05)，其中miR-145和miR-484在乳腺癌组和健康对照组的表达差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。图中方框内横线代表中位数，方框所表示的区域指25%～75%百分位数区间，方框外的小横线代表10%～90%的百分位数区间，小圆点指在10%～90%的百分位数区间以外的值。

表1 乳腺癌组显著表达的miRNA

图1 miR-484和miR-145在乳腺癌组和健康对照组中相对表达情况

2.2 miR-484和miR-145鉴别乳腺癌的诊断价值 检测验证组miR-484和miR-145的相对表达量，单独使用miR-484和miR-145作为乳腺癌的标志物作ROC曲线，得到AUC分别为0.928(95%CI： 0.901～0.959)和0.623(95%CI： 0.513～0.725)，见图2。为了提高肿瘤的诊断价值，联合使用miR-484和miR-145一起作为区分乳腺癌患者与健康对照者的生物标志物作ROC曲线，得到AUC为0.965(95%CI： 0.939～0.984)，见图3。此时灵敏度和特异度分别为91.3%(95%CI： 85.2%～95.4%)和90.8%(95%CI： 83.7%～93.6%)，阳性预测值为91.0%，阴性预测值为91.0%。

图2 单独使用miR-484和miR-145作为乳腺癌标志物的ROC曲线及AUC

图3 联合使用miR-484和miR-145作为乳腺癌标志物的ROC曲线及AUC

3 讨 论

本研究通过对30例乳腺癌患者和20例健康对照者血浆使用qRT-PCR检测，共筛选出6个候选标志物，再通过统计分析找到差异最显著的2个标志物——miR-484和miR-145，然后进行诊断价值评价。单独使用miR-484和miR-145作为乳腺癌的诊断标志物时，其ROC的AUC分别为0.928(95%CI： 0.901～0.959)和0.623(95%CI： 0.513～0.725)，诊断效能不甚理想。为了提高乳腺癌的诊断价值，联合使用miR-484和miR-145作为区分乳腺癌患者与健康对照者的生物标志物，ROC的AUC为0.965(95%CI： 0.939～0.984)，此时灵敏度和特异度分别为91.3%(95%CI： 85.2%～95.4%)和90.8%(95%CI： 83.7%～93.6%)，阳性预测值为86%，阴性预测值为91%。说明miR-484和miR-145对乳腺癌的诊断有十分重要的价值，虽然本研究数据显示了较好的诊断效能，但若要应用于临床，仍需扩大标本量和细化分组，或对乳腺癌分期分型再进行标志物的筛选，以提高诊断的特异性。

Li等[12]比较了19例胰腺癌患者和10例健康对照者血清miRNA，发现miR-484在胰腺癌中表达显著增高；Vecchione等[13]发现在对化疗不敏感的卵巢癌中miR-484表达减低；另外关于miR-484与恶性肿瘤的关系，有研究指出其在表皮恶性黑色素瘤中(相对于良性黑色素痣而言)是10个重要的上调miRNA之一[14]。Volinia和Croce[15]通过分析466例乳腺癌患者的生存情况认为，miR-484水平的高低与Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌的预后有重要相关性。miR-145是公认的抑癌基因，在多种肿瘤的发生中，通过抑制细胞生长从而达到抑癌作用[16-17]。可见各种miRNA在肿瘤中的表达并非特异的，因此，单独将某一种miRNA作为癌症的诊断标志物是不理想的，所以在单独使用miR-484作为乳腺癌的诊断标志物时，在ROC的AUC达0.928的情况下，为了增加其特异性和提高诊断效能，本研究依然考虑将miR-484和miR-145作为联合诊断标志物来计算其诊断效能，结果显示，联合诊断ROC的AUC达0.965，诊断效能有了明显提高。结果中显示miR-484在乳腺癌中高表达，而miR-145在乳腺癌中低表达，这也为后期研究提供了很好的思路，即研究标志物的作用机制。这样，标志物不仅可以作为疾病诊断和预后判断的标准，同时也可以阐明疾病发生、发展的机制，纵向加深了研究的深度。

综上所述，尽管本研究尚有一些局限，但血浆miR-484和miR-145仍不失作为乳腺癌有效的诊断标志物，下一步研究可加大标本量验证和进行miRNA对乳腺癌发病机制的研究。

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Research of circulating miR-145 and miR-484 in the diagnosis of breast cancer*

HUANGYuan-shuai1,ZHOUWei-xin2,LUOBin-rui2,GUOTian-hong2

(1.DepartmentofTransfusion,theFirstAffiliatedHospitalofSichuanMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China;2.GraduateSchoolofSichuanMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

Objective To explore the expression changes of miRNAs in the plasma of patients with breast cancer and to evaluate their significance,so as to find new biomarkers for the detection of breast cancer.Methods Plasma miRNA levels of 30 cases of patients with breast cancer and 20 cases of healthy controls in training group were measured by qRT-PCR.The diagnosis values of the candidate miRNAs were validated by blind method in test group (including 20 cases of patients with breast cancer and 20 cases of healthy controls).Results In training group,there were 6 differentially expressed miRNAs (P<0.05),in which miR-145 and miR-451 expressed significantly different from the other 4 miRNAs (P<0.05).The result of blind validation showed that a combination of miR-145 and miR-484 could be effective in the differential diagnosis between patients with breast cancer and healthy controls.And the AUC,sensitivity,specificity,positive predictive value and negative predictive value of combination detection were 0.965,91.3% (95%CI85.2%-95.4%),90.8%(95%CI83.7%-93.6%),91.0% and 91.0%,respectively.Conclusion Plasma miR-145 and miR-484 could be potential specific biomarkers for breast cancer screening.

breast cancer; miR-145; miR-484; ROC curve; sensitivity

四川省卫生厅课题资助项目(120336)。

黄远帅，男，博士，副研究员，主要从事microRNA与疾病关系的研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.24.005

A

1672-9455(2015)24-3623-03

2015-07-20

2015-09-15)