胰腺癌的动物模型研究

尹　航　刘海林

上海交通大学医学院附属第九人民医院消化内科(201011)

胰腺癌的动物模型研究

尹航刘海林#

上海交通大学医学院附属第九人民医院消化内科(201011)

胰腺癌恶性程度高、早期诊断困难、病程短、进展快、预后差。据2011年中国肿瘤登记年报，胰腺癌发病率为8.55/10万，在所有肿瘤中居第7位；死亡率为7.56/10万，居第6位，中位生存时间仅为4~6个月，平均5年生存率不足5%[1]。胰腺癌因其临床表现缺乏特异性，早期诊断困难，手术切除率低，难以获得不同发病阶段的胰腺癌组织标本以及在临床上观察其发生、发展过程。因此，通过胰腺癌动物模型，可在动物体内模拟人类胰腺癌的发生、发展过程，为深入研究胰腺癌的发生、发展机制以及指导治疗奠定基础。目前，胰腺癌的动物模型主要分为化学药物诱导模型、移植瘤模型和基因工程模型三类。本文就胰腺癌动物模型的制备方法、实验用途、临床相关性、局限性作一综述。

一、化学药物诱导模型

化学药物诱导模型通过应用化学致癌剂使细胞发生恶变引起胰腺癌。实验动物多选择小鼠、仓鼠等啮齿类动物，给药途径包括喂食、皮下注射，也可将致癌物直接置入胰腺。建模时间一般需3~7个月。早在20世纪70年代，Pour等[2]采用N-亚硝酸-双(2-氧丙基)胺(BOP)成功诱导了金黄地鼠胰腺癌模型。BOP诱导的胰腺癌主要起源于胰岛内和岛周小管上皮细胞，其组织类型为腺瘤或腺癌。此胰腺癌模型不仅肿瘤导管表型与人类极其相似，而且亦常表现出与人胰腺癌相似的促结缔组织增生反应以及嗜神经生长特性。此后，又有多种致癌物被用于诱导小鼠胰腺癌，包括1-氧-4羟基氨基喹啉(4-HAQO)、偶氮丝氨酸(azaserine)、二甲基苯并蒽(DMBA)等。Wang等[3]采用胰腺局部包埋种植DMBA进行诱导，成功建立了大鼠胰腺上皮内瘤变(PanIN)和早期胰腺导管腺癌(PDAC)模型，人工模拟了大鼠由正常胰腺逐级发展为胰腺癌的动态变化过程。

化学药物诱导模型可在较短时间内表现出与人胰腺癌发生、发展类似的过程。但由于致癌剂特异性差，在诱发胰腺癌的同时，亦可引起其他部位肿瘤，并且诱导周期较长，死亡率高，不同个体间胰腺癌出现的时间、部位以及病灶数量等不均一，从而限制了其广泛应用[2]。

二、移植瘤模型

选用免疫缺陷动物如BALB/c-nu小鼠，在皮下或胰腺植入胰腺癌细胞株或胰腺癌组织，建立皮下种植瘤模型或原位移植瘤模型。皮下种植瘤模型费用低、操作简单、可测量肿瘤大小，因此在研究肿瘤生理、大规模药物初筛中具有重要价值[4]。但该模型具有一定缺陷：①小鼠自身组织污染、细胞微环境的改变可能导致细胞基因表型改变；②忽略了宿主免疫系统对肿瘤生长的调节，使其不能真实反映肿瘤在人体内生长的情况；③皮下种植的胰腺癌模型常表现为局部浸润生长，虽可侵犯周围神经组织，但罕有远处转移，亦不表现肿瘤侵犯血管和脏器所引起的症状，此与人体内胰腺癌的生长方式不相符，并非是研究肿瘤发生、进展的理想模型。

与皮下种植瘤模型相比，胰腺癌原位移植瘤模型与人类胰腺癌的生理特征相似度更高，肿瘤微环境更贴近人类，可更有效地对胰腺癌局部病灶和远处转移进行模拟研究，更好地预测药物干预在人体中的疗效。但原位移植瘤亦有诸多缺陷，如操作复杂、费用较高、对胰腺损伤大、术后恢复时间长等。为此，Huynh等[5]在超声引导下将胰腺癌细胞注入主胰管进行造模，该方法可防止注射并发症，减少注射时间，并缩短术后恢复时间。Tsuji等[6]将胰腺癌细胞用红色或绿色荧光蛋白标记后注入小鼠胆总管，5 d后可在胰管内发现标记的肿瘤细胞生长，28 d可发现肿瘤浸润整个胰腺，从而成功建立动物模型，并进行无损伤动态观测。Kunnumakkara等[7]将荧光素酶基因转入胰腺癌细胞，采用生物发光显像系统对胰腺癌原位移植瘤及其转移灶的光信号值进行检测，以评估肿瘤大小。尽管与皮下移植瘤相比，胰腺癌原位移植瘤有较大优势，但移植受体仍缺乏对肿瘤生长和转移的免疫反应，并不能模拟真实肿瘤生长环境。为弥补此缺陷，有学者[8]通过注射人胚胎胸腺组织和CD34+造血干细胞至NOD/SCID小鼠体内，建立人源化免疫重建小鼠系统。

三、基因工程小鼠(GEM)模型

近年来，诸多研究趋向于应用基因工程技术，通过某些组织特异性启动子的控制，将癌基因引入小鼠胚胎细胞或体细胞，靶向作用于胰腺，诱导小鼠发生胰腺癌。同时，探索多个基因的相互作用，建立与人胰腺癌更为相似的动物模型。从基因工程技术角度，可分为转基因小鼠、基因替换/敲除小鼠、条件性基因替换/敲除/敲入小鼠以及诱导式转基因小鼠模型等。

1. 转基因小鼠模型：转基因小鼠是在其他GEM出现前的一个技术突破。Richmond等[9]应用Elastase启动子成功制备Ela-K-rasG12D小鼠，发现表达K-ras的小鼠仅表现胰腺癌前病变，并未诱导生成PDAC，并证实K-ras基因是胰腺癌的始动因素，但需与其他基因相互作用才能诱发PDAC。Arvanitis等[10]的研究指出，当C-MYC基因插入至Elastase启动子后，胰腺腺泡细胞失去正常表型逐渐转化为导管样细胞，在此基础上联合转入转化生长因子-α，小鼠生长1年后出现由介于导管和腺泡间的细胞组成的腺管样复合物，并可进一步产生腺泡癌或腺泡/导管混合癌表型，并伴随广泛的胰腺腺泡纤维化，此揭示了腺泡细胞向导管细胞化生的过程。

转基因小鼠模型的最大缺陷是其插入了2个等位基因，不同于人类肿瘤基因组中1个等位基因为野生型，1个为突变型。此外，在制备转基因小鼠的过程中，通过微注射使外源性DNA进入宿主基因组的效率较低，且转基因位点的不确定性常导致难以预期的表型，并可能引起严重不良反应。最近有学者[11]应用整合酶介导的显微原核注射法进行位点特异性转基因，成功将1个完整的单链DNA转入预定的染色体位点，其效率约为40%，有望成为制备GEM的新手段。

2. 基因替换/敲除小鼠模型：该模型是根据基因同源重组原理，使特定靶基因完全失活或缺失(基因敲除)，或以1种基因替换另1种基因(基因替换)，以便在体内测定其是否具有相同功能。Tuveson等[12]应用基因替换技术，将K-ras基因定点插入Mist1位点。Mist1在小鼠胚胎发育过程中表达于胰腺腺泡细胞，是胰腺腺泡表型完全成熟的必需因子。Mist1-K-rasG12D/+小鼠可表现为胰腺腺泡-导管化生、增生，若同时伴有p53基因突变，则可观察到PanIN和PDAC的病理学改变以及肝脏转移。

基因替换/敲除技术所获得的动物模型，其基因突变可发生于动物的各种组织、器官，并存在于发育的各个时期，此与胰腺癌在人体内发生、发展过程不一致。此外，传统基因敲除方法可能使胚胎不能发育至正常分娩，或因严重的生理缺陷而过早死亡，无法开展后续研究。

3. 条件性基因替换/敲除/敲入小鼠模型：条件性基因敲除技术能使基因修饰限制于动物体内的特定范围或发育的特定阶段，从而对基因突变在时间、空间上加以准确控制，以便更精确地研究基因功能。Cre/loxp重组酶系统是最常用的条件性基因敲除策略。

2003年Hingorani等[13]应用条件性基因替换技术，通过杂交K-rasLSL.G12D小鼠和表达胰腺组织特异性Pdx-Cre重组酶小鼠，构建了K-rasLSL.G12D；Pdx1-Cre小鼠(亦称KC小鼠)。小鼠在出生时胰腺组织结构表现正常，8周后出现早期PanIN，2年内PanIN程度逐渐进展，其中一小部分小鼠进展为PDAC，中位生存期14个月。KC小鼠存在潜伏期较长，且较少出现进展性胰腺癌等缺点，限制了其在临床前期研究中的应用，因此在KC小鼠基础上联合其他基因敲除技术可能是更佳方案。Aguirre等[14]的研究发现，K-rasLSL.G12D; Pdx1-Cre; CDKN2Alox/lox小鼠在胰腺K-ras变异的同时出现编码肿瘤抑制因子p16Ink4a和p19Arf的CDKN2A缺失，此种小鼠表现为快速进展、高侵袭性的导管腺癌，出现类似人胰腺癌的临床 表现如胆管梗阻、体重减轻、血性腹水等，且100%在11周 内发生死亡。同样，联合条件性基因敲除K-rasLSL.G12D; p53R172H/+; Pdx1-Cre小鼠(亦称KPC小鼠)出生时表现正常，6周时即出现与KC小鼠相似的PanIN，10周时加速进展为PDAC，平均中位生存时间5.5个月。80%的KPC小鼠可发生肝脏、肺、腹膜转移，其肿瘤组织表达的相关免疫组化标志更近似于人胰腺癌模式，现已广泛应用于临床前期药物筛选研究中[15]。研究[16-17]显示，对KPC小鼠进一步行透明质酸酶基因敲除后，肿瘤血管结构改变，肿瘤间质内液体压力减轻，吉西他滨转运效率提高。接受透明质酸酶基因敲除联合吉西他滨治疗的KPC小鼠的生存期较单用吉西他滨的KPC小鼠延长2倍，提示透明质酸酶参与KPC小鼠胰腺癌的发生、发展。Beatty等[18]应用CD40拮抗剂CP-870-893联合吉西他滨治疗转移性PDAC，采用KPC小鼠进行研究，发现KPC小鼠对CP-870-893联合吉西他滨治疗有效，巨噬细胞参与此抗肿瘤效应。

Hedgehog信号通路在胚胎生长发育和组织形成中具有重要作用，该通路异常激活与多种肿瘤发生、发展密切相关。为明确Hedgehog通路活化在胰腺癌发生中的作用，构建了Pdx1-Cre; CLEG2条件性基因敲入模型小鼠，此小鼠发生上皮特异性转化，出现胰腺肿瘤，但其组织学并不同于PDAC，表现为未分化的纺锤形细胞。当该模型与K-rasG12D小鼠杂交后，在Hedgehog通路与K-ras共同作用下，小鼠出现广泛的癌前病变，肿瘤生成加速，形成PDAC，与K-rasG12D小鼠相比生存期明显缩短，提示Hedgehog信号与K-ras协同作用于早期PDAC[19]。Notch信号通路在胚胎发育过程中起重要作用，亦参与多种肿瘤的发生，且可对不同肿瘤的发生、发展起相反作用。在胰腺癌研究中对Notch1信号通路的作用存在争议，多数研究[20-21]认为Notch1通路激活可促进胰腺癌的发生、发展。Hanlon等[22]对Pdx1-Cre; CreERT; K-rasG12D; R26-Notch条件性基因敲除模型小鼠研究发现，Notch1高表达可使胰腺腺泡细胞对K-ras基因突变的反应性增加，从而促使胰腺腺泡细胞向导管细胞化生，形成PanIN和PDAC。

4. 诱导式转基因小鼠模型：诱导性基因敲除技术可对基因转录时间进行调控，从而避免目标基因在动物发育早期即发生表达缺陷。诱导性基因敲除技术以Cre/LoxP系统为基础，利用诱导剂在时间上对Cre重组酶活性加以控制，从而使目标基因在模型特定组织中的突变具有时间可控性。

目前常用的有他莫昔芬诱导的Cre-ER重组酶系统。Mist1-CreERT; K-rasLSL-G12D小鼠仅能形成低级别PanIN，不能发展至PDAC[23]。Pdx1-CreERT; LSLK-ras小鼠可见PanIN形成的导管上皮化生[24]。Pdx1-CreERT; LSLK-ras; R26-模型小鼠由于Notch通路被激活，从而增强了胰腺腺泡细胞对K-ras的敏感性，表现为腺泡细胞起源的PanIN加速进展[20]。

另一常用的诱导系统是基于大肠杆菌的Tet-ON/OFF操纵子系统。此系统包含两种转基因：四环素控制的转录激活物(tTA)和tTA依赖的启动子tetO。tTA是四环素的抑制物和单纯疱疹病毒VP16的C末端部分拼接体，tetO是RNA聚合酶Ⅱ的启动子和四环素操纵子的拼接体，两者下游是被调节的目的基因。由于Tet诱导系统可能为tet-ON或tet-OFF，因此添加四环素后可激活或抑制转录活性。Guerra等[25]的研究发现，Ela-tTA/tetO-Cre; LSL-KrasG12V小鼠模型在tet-OFF系统中表达Cre重组酶，因此在缺乏强力霉素时，Elastase驱动的Cre重组酶可使沉默的LSL-K-rasG12V等位基因活化，小鼠表现为导管上皮细胞化生，可观察到PanIN和PDAC的发生。Ying等[26]的研究显示，Ptf1a-Cre; R26rtTA; tetO-LSL-K-rasG12D; p53lox/+小鼠在出生后持续喂食多西环素，可成功诱导小鼠出现PanIN和PDAC，终止用药后，K-ras活化表达受抑制，肿瘤细胞停止化生，组织结构和间质复原。

5. 其他：上述GEM模型的一大缺点是用时过长，基本耗时1年左右。近年发现的新型基因敲除技术，如类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)和CRISPR/Cas9打靶系统可对目的基因进行定点敲除，目前已应用于包括人体在内的哺乳动物实验中[27-29]。CRISPR/Cas9具有操作简单、效率高、成本低、可同时沉默任意数量的基因等优点，理论上更适合应用于胰腺癌等多基因相互作用疾病的研究，但目前尚无应用该技术建立胰腺癌GEM模型的报道。

四、结语

近几十年来为研究胰腺癌的发生、发展以相关治疗，构建了诸多胰腺癌动物模型，其部分模拟了人类胰腺癌的疾病特点，但尚无一种模型可满足所有研究的需要。皮下移植瘤操作简单、费用少，可方便观察肿瘤大小，并通过肿瘤生理研究体内特定基因功能以及进行药物初筛，但其与人体内环境的相似度较低。原位注射胰腺癌细胞形成的原位移植瘤可形成与人胰腺癌相似的血运系统以及肿瘤生长微环境，但缺乏必要的肿瘤基质细胞和免疫系统，限制了其进一步应用。原位胰腺癌组织块移植不仅较好地保留了胰腺肿瘤的组织结构特点，可诱导基质形成，且保留了肿瘤组织的异质性，但同样缺乏宿主免疫系统反应。GEM模型可用于胰腺癌相关基因的研究，探索肿瘤细胞起源以及胰腺癌的发生、发展过程，尤其是胰腺癌早期的变化，但亦有其局限性：①间质生长是人侵袭性胰腺癌的重要特征，但在GEM模型中较少见；②在人胰腺癌中，K-ras突变发生于早期，先于抑癌基因的缺失，而在GEM模型中K-ras与抑癌基因的突变为同时发生；③在GEM模型中发现的新肿瘤标志或治疗靶点在人体中无相应配体；④建模周期长，价格昂贵，难以大量建模，且转基因产物不一定符合要求，难以确保转基因产物不会对肿瘤浸润、转移等生物学行为产生影响。综上所述，在实际应用中，需通过分析各种模型的优缺点，以便更好地研究胰腺癌发生、发展过程及其浸润、转移等生物学行为。

参考文献

1 中华医学会肿瘤学分会胰腺癌学组(筹). 胰腺癌多学科综合治疗协作组专家共识[J]. 中华肿瘤杂志, 2013, 35 (5): 398-400.

2 Pour P, Althoff J, Kruger FW, et al. A potent pancreatic carcinogen in Syrian hamsters: N-nitrosobis(2-oxopropyl)amine[J]. J Natl Cancer Inst, 1977, 58 (5): 1449-1453.

3 Wang L, Liu HL, Li Y, et al. Proteomic analysis of pancreatic intraepithelial neoplasia and pancreatic carcinoma in rat models[J]. World J Gastroenterol, 2011, 17 (11): 1434-1441.

4 Jimeno A, Feldmann G, Suarez-Gauthier A, et al. A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development[J]. Mol Cancer Ther, 2009, 8 (2): 310-314.

5 Huynh AS, Abrahams DF, Torres MS, et al. Development of an orthotopic human pancreatic cancer xenograft model using ultrasound guided injection of cells[J]. PLoS One, 2011, 6 (5): e20330.

6 Tsuji K, Yang M, Jiang P, et al. Common bile duct injection as a novel method for establishing red fluorescent protein (RFP)-expressing human pancreatic cancer in nude mice[J]. JOP, 2006, 7 (2): 193-199.

7 Kunnumakkara AB, Sung B, Ravindran J, et al. Zyflamend suppresses growth and sensitizes human pancreatic tumors to gemcitabine in an orthotopic mouse model through modulation of multiple targets[J]. Int J Cancer, 2012, 131 (3): E292-E303.

8 Shultz LD, Saito Y, Najima Y, et al. Generation of functional human T-cell subsets with HLA-restricted immune responses in HLA class Ⅰ expressing NOD/SCID/IL2r gamma(null) humanized mice[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010, 107 (29): 13022-13027.

9 Richmond A, Su Y. Mouse xenograft modelsvsGEM models for human cancer therapeutics[J]. Dis Model Mech, 2008, 1 (2-3): 78-82.

10Arvanitis C, Felsher DW. Conditionally MYC: insights from novel transgenic models[J]. Cancer Lett, 2005, 226 (2): 95-99.

11Tasic B, Hippenmeyer S, Wang C, et al. Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011, 108 (19): 7902-7907.

12Tuveson DA, Zhu L, Gopinathan A, et al. Mist1-KrasG12D knock-in mice develop mixed differentiation metastatic exocrine pancreatic carcinoma and hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Res, 2006, 66 (1): 242-247.

13Hingorani SR, Petricoin EF, Maitra A, et al. Preinvasive and invasive ductal pancreatic cancer and its early detection in the mouse[J]. Cancer Cell, 2003, 4 (6): 437-450.

14Aguirre AJ, Bardeesy N, Sinha M, et al. Activated Kras and Ink4a/Arf deficiency cooperate to produce metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. Genes Dev, 2003, 17 (24): 3112-3126.

15Hingorani SR, Wang L, Multani AS, et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice[J]. Cancer Cell, 2005, 7 (5): 469-483.

16Jacobetz MA, Chan DS, Neesse A, et al. Hyaluronan impairs vascular function and drug delivery in a mouse model of pancreatic cancer[J]. Gut, 2013, 62 (1): 112-120.

17Provenzano PP, Cuevas C, Chang AE, et al. Enzymatic targeting of the stroma ablates physical barriers to treatment of pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. Cancer Cell, 2012, 21 (3): 418-429.

18Beatty GL, Chiorean EG, Fishman MP, et al. CD40 agonists alter tumor stroma and show efficacy against pancreatic carcinoma in mice and humans[J]. Science, 2011, 331 (6024): 1612-1616.

19Morris JP, Wang SC, Hebrok M. KRAS, Hedgehog, Wnt and the twisted developmental biology of pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. Nat Rev Cancer, 2010, 10 (10): 683-695.

20Nakhai H, Siveke JT, Klein B, et al. Conditional ablation of Notch signaling in pancreatic development[J]. Development, 2008, 135 (16): 2757-2765.

21Maniati E, Bossard M, Cook N, et al. Crosstalk between the canonical NF-κB and Notch signaling pathways inhibits Pparγ expression and promotes pancreatic cancer progression in mice[J]. J Clin Invest, 2011, 121 (12): 4685-4699.

22Hanlon L, Avila JL, Demarest RM, et al. Notch1 functions as a tumor suppressor in a model of K-ras- induced pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. Cancer Res, 2010, 70 (11): 4280-4286.

23Shi G, Zhu L, Sun Y, et al. Loss of the acinar-restricted transcription factor Mist1 accelerates Kras-induced pancreatic intraepithelial neoplasia[J]. Gastroenterology, 2009, 136 (4): 1368-1378.

24Shen R, Wang Q, Cheng S, et al. The biological features of PanIN initiated from oncogenic Kras mutation in genetically engineered mouse models[J]. Cancer Lett, 2013, 339 (1): 135-143.

25Guerra C, Schuhmacher AJ, Caamero M, et al. Chronic pancreatitis is essential for induction of pancreatic ductal adenocarcinoma by K-Ras oncogenes in adult mice[J]. Cancer Cell, 2007, 11 (3): 291-302.

26Ying H, Kimmelman AC, Lyssiotis CA, et al. Oncogenic Kras maintains pancreatic tumors through regulation of anabolic glucose metabolism[J]. Cell, 2012, 149 (3): 656-670.

27沈延，肖安，黄鹏，等. 类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)介导的基因组定点修饰技术[J]. 遗传, 2013, 35 (4): 395-409.

28Mali P, Yang L, Esvelt KM, et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9[J]. Science, 2013, 339 (6121): 823-826.

29Blasco RB, Karaca E, Ambrogio C, et al. Simple and rapidinvivogeneration of chromosomal rearrangements using CRISPR/Cas9 technology[J]. Cell Rep, 2014, 9 (4): 1219-1227.

(2014-05-13收稿； 2014-06-27修回)

摘要胰腺癌恶性程度高、进展快、预后差，在我国位居肿瘤死亡率的第6位。为了研究胰腺癌的发生、发展机制，目前已建立了多种胰腺癌动物模型。本文就胰腺癌动物模型的制备方法、实验用途、临床相关性、局限性作一综述。

关键词胰腺肿瘤；动物模型；基因工程小鼠；转基因

Animal Models of Pancreatic CancerYINHang,LIUHailin.DepartmentofGastroenterology,ShanghaiNinthPeople’sHospitalAffiliatedShanghaiJiaotongSchoolofMedicine,Shanghai(201011)

Correspondence to: LIU Hailin, Email: liuhailin@medmail.com.cn

AbstractPancreatic cancer is a highly malignant disease with rapid progress and poor prognosis, and is the sixth leading cause of cancer death in China. A variety of animal models of pancreatic cancer have been developed, which provide useful tools for studying the occurrence and development of pancreatic cancer. In this review, we provide a brief description of the animal models of pancreatic cancer currently available, including preparative method, experimental use, clinical relevance and limitation.

Key wordsPancreatic Neoplasms;Models, Animal;Genetically Engineered Mouse;Transgenes

通信作者#本文，Email: liuhailin@medmail.com.cn

DOI:*本课题由上海市科委基础重点项目(10JC1409001)资助